药物靶点筛选：ABPP化学蛋白质组学揭示天然产物咖啡酸靶向A

药物靶点筛选：ABPP化学蛋白质组学揭示天然产物咖啡酸靶向ANXA5靶点

本研构建了涵盖化合物筛选、靶点发现、机制阐释的完整研究框架。通过化学蛋白质组学筛选锁定靶点ANXA5，结合MST等实验证实其直接结合，揭示CA减轻衰老相关炎症和肺纤维化的机制。

一、案例介绍

Exploration（IF 22.5）| ABPP结合MST、CETSA、小分子pull down以及分子对接技术揭示咖啡酸靶向ANXA5发挥功能

2025年12月，中国中医科学院中药研究所团队在Exploration在线发表题为“Caffeic Acid Acts as a Potent Senomorphic and Alleviates Inflammation and Lung Fibrosis by Covalently Targeting Annexin A5 Protein in Mice”的研究文章。

本研究通过“以药找靶”技术 ABPP 结合分子互作验证手段（MST、CETSA、 分子对接及小分子pull down），从多维度验证了天然产物与靶蛋白的直接结合关系，系统阐明了其减轻衰老相关炎症和肺纤维化的分子机制。

1、抗衰老化合物筛选鉴定

为了从天然产物中筛选鉴定抗衰老化合物，作者采用了如下系统进行筛选鉴定：通过使用顺铂对 A549 细胞进行处理，使其进入衰老状态，并通过衰老相关性β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色对其进行了表征。用10µM的化合物（TCM数据库及饮食相关的化合物）孵育衰老细胞24 h后，采用ELISA法测定细胞培养液中3种具有代表性的炎性因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的含量，评价化合物对SASP分泌的抑制作用。

在这些化合物中，咖啡酸（CA）是一种具有抗氧化和抗炎活性的天然产物，广泛存在于食品和中药中，可以有效地将三种细胞因子的分泌降低到控制水平，并表现出最佳的SASP抑制活性，因此选择CA进行后续分析。

图1 抗衰老化合物筛选鉴定

2、CA作用靶点鉴定及相互作用验证（ABPP化学蛋白质组学）

为了寻找CA的作用靶点，作者采取了ABPP的实验方法（图2）：取A549细胞分成3组（DMSO，IAA-yne，CA），将上述化合物分别与细胞孵育，孵育完成裂解细胞后，竞争组再加入IAA-yne，反应完成再通过点击化学反应进行生物素标记，随后使用胰酶裂解，利用链霉亲和素进行富集并随后进行质谱鉴定。

通过质谱分析实验组、对照组和竞争组，发现ANXA5在竞争组中显著降低。推测ANXA5可能是CA的潜在靶点。（图2B，检测CA是否能够共价结合目的蛋白的半胱氨酸残基，其中已知IAA-yne能与蛋白的半胱氨酸残基形成共价键；图2C、D，通过质谱鉴定实验组和竞争组中多肽，CA能显著降低ANXA5蛋白316位半胱氨酸的I乙酰化；图2E，pull down实验证明CA能显著降低IAA-yne与ANXA5的结合）

图2 ABPP鉴定CA的潜在蛋白靶点

3、CA与ANXA5相互作用验证

为了验证CA和ANXA5的直接相互作用，首先通过pull down实验，发现100µm CA完全抑制了10µm IAA探针标记的ANXA5的荧光信号（图3A）；然后通过MST（微量热泳动）实验，证明二者的KD值为3.68 uM（图3B）；随后通过CETSA细胞热迁移实验，证明随着温度升高，CA能提高ANXA5蛋白的热稳定性（图3C、D）；通过小分子pull down和突变实验，证明CA和ANXA5在体外能直接结合，并且CYS316是CA结合的关键氨基酸位点（图3E、F）；通过共价对接，证明CA能与ANXA5形成共价键（图3G）；并且基因沉默ANXA5之后，CA抑制SASP分泌的功能被破坏，证明CA 通过靶向 ANXA5 来抑制衰老细胞中 SASP 的分泌（图3H、I、J）。

图3 MST微量热泳动、CETSA细胞热迁移、小分子pull down、分子对接验证CA和ANXA5结合

二、相关技术简介

ABPP（化学蛋白质组学）

ABPP是一种先进的化学蛋白质组学策略。它巧妙地结合了基于活性的探针（Activity-Based Probes, ABPs）和高通量的蛋白质组学技术，旨在识别和鉴定活性小分子的蛋白质靶标。ABPP技术的核心在于利用经过精心设计和改造的小分子探针作为“诱饵”，特异性地捕获并标记与活性小分子发生相互作用的靶点蛋白质。随后，通过高效的富集和鉴定流程，深入阐明活性小分子发挥作用的分子机制。

MST（微量热泳动）

通过红外激光在样品中制造一个微观温度梯度场，荧光标记的靶分子（Target）会发生定向移动。当靶分子与配体（Ligand）结合后，其复合物的尺寸、水化层和电荷等物理性质会发生改变，导致热泳动速度随之变化。MST技术通过检测加热后局部荧光强度的变化来监测这种热泳动行为的改变，并以此为基础，计算出分子间的解离平衡常数（KD值），从而定量分析分子间的相互作用亲和力

CETSA（细胞热迁移）

CETSA细胞热迁移技术是一种在活细胞水平（培养细胞、活体组织、活性蛋白等）鉴定靶标蛋白的技术。原理为药物和靶蛋白结合后，会使靶蛋白的热稳定性（Tm值）改变。加药组和未加药组样品经过热处理后，离心去除变性蛋白，然后通过Western blot检测上清中靶蛋白含量，测定靶蛋白的热稳定性（Tm值）变化，从而确定靶蛋白和药物在生理水平上是否有相互作用。

分子对接（molecular docking）

MD分子对接是计算生物学领域的经典工具，主要用于模拟小分子与蛋白质之间的结合位点、空间构象与结合能变化。其原理是通过算法预测小分子在蛋白受体结合口袋中的最佳结合模式，并评估其结合强度（如结合能评分）及相互作用类型（如氢键、疏水作用、静电吸引等），该技术可为小分子筛选和靶点假设提供理论依据和优先排序。

siRNA

siRNA（small interfering RNA，小干扰RNA）是一种双链非编码RNA分子，通常长约20-25个核苷酸，通过RNA干扰（RNAi）机制在转录后水平沉默特定基因表达。 其原理是siRNA进入细胞后，与RNA诱导沉默复合物（RISC）结合，识别并降解互补的靶mRNA，从而阻止蛋白质合成，实现基因沉默。可用于靶点功能验证。

三、参考文献

Y. Zhu, Y. Zhang, Q. Zhang, et al. “ Caffeic Acid Acts as a Potent Senomorphic and Alleviates Inflammation and Lung Fibrosis by Covalently Targeting Annexin A5 Protein in Mice.” Exploration (2025): 20240069.

ABPP样品准备要求：

1、送样形式以细胞沉淀或者提取的总蛋白溶液

2、探针2-3mg，原料药5mg，冰袋寄送即可，也可与细胞或蛋白样品一起寄送

3、细胞沉淀需要6×10⁷及以上，沉淀经PBS清洗三次，去除残留PBS，以沉淀形式寄送

4、总蛋白浓度3mg/ml及以上，不少于4ml（注：所用裂解液必须为弱裂解液，需要保持蛋白活性，蛋白酶抑制剂需使用质谱兼容型）

5、细胞及蛋白样品使用干冰寄送，干冰用量5kg/天（即快递需要1天，使用5kg干冰；2天使用10kg干冰，依次类推）

四、更多技术服务

本研究中所使用的 ABPP技术、MST微量热泳动、CETSA细胞热迁移、分子对接技术均为佰莱博生物分子表征平台可提供的服务项目。