CETSA细胞热迁移技术实验服务

细胞热迁移技术(cell thermal shift assay, CETSA)实验服务

1.CETSA  技术基本原理

2013年瑞典卡罗琳斯卡(Karolinska)研究所开发了一种可以在体内检测药物与靶标蛋白结合强度的方法，即细胞热迁移技术(cell  thermal  shift assay, CETSA)技术。CETSA 技术,由体外热迁移技术(thermal shift assays, TSA)发展而来。

TSA 是基于蛋白质随着温度增加而逐渐变性的原理来表征蛋白质热稳定性的技术。执行特定功能的蛋白质在细胞内具有稳定的三维结构，但随着环境的改变（如pH值或者温度）蛋白的变性或解折叠就会迅速发生。对蛋白质而言，随着温度升高，部分蛋白会逐渐变性沉淀，当温度升高到某个值时，有50%的蛋白质发生变性，此时的温度称为熔解温度(melting  point, Tm)。当温度超过 Tm 时，变性蛋白的数量大于未变性蛋白的数量，蛋白聚集呈指数增加，直至全部蛋白质分子变性聚集而沉淀。

Tm 作为蛋白质结构稳定性的指标之一，其值越高蛋白质的热稳定性越好。Tm 与溶液的 pH 值、盐浓度以及蛋白的翻译后修饰等有关，配体的结合也会稳定蛋白质构象，从而使蛋白质的 Tm 值升高。TSA 技术广泛应用于检测药物与蛋白质在体外的相互作用，以及体外筛选特定蛋白的候选药物等、酶热稳定性测定、保存蛋白质的制剂筛选等。

虽然 CETSA 技术和 TSA 技术原理相同，都是基于蛋白质热变性原理，但 CETSA 技术是一种在活细胞水平(培养细胞、活体组织等)鉴定靶标蛋白的新方法。加热处理细胞时， 随着温度的升高蛋白质逐渐变性沉淀，有活性的可溶性蛋白量逐渐减少，通过生化分析手段如 Western blotting 、 MALDI-TOF-MS 等就能够绘制出特定蛋白的可溶性蛋白含量随温度变化的曲线即熔解曲线。

对特定蛋白而言，可溶性蛋白量与变性蛋白量相等时的温度，或者可溶性蛋白量占总蛋白量一半时的温度，称为聚集温度 (aggregation temperature) 等同于熔解温度(Tm)。当细胞经药物处理后，药物和靶蛋白结合，使靶蛋白的热稳定性增强，Tm 值增加。根据药物处理前后 Tm 的变化情况，就可以确定靶蛋白和药物在生理水平上是否有相互作用。

每种蛋白质都有自身的熔解曲线（如图1）。随着温度的升高，蛋白质会发生降解（蓝色曲线，代表未加药）；当蛋白质结合小分子以后，该复合蛋白的熔解曲线会右移（红色虚线），即相同温度下，未降解蛋白的量会提高。CETSA 实验的样品来源十分灵活，可以是细胞，也可以是活体给药以后的组织样本。

 图1 CETSA  示意图

CETSA 方法还能评估在恒定温度下，随着配体浓度增加，靶标蛋白质可溶性蛋白量的变化，绘制等温剂量反应曲线(isothermal dose-reponse fingerprint, ITDRF)，计算药物的有效浓度，为药物的使用提供参考。

根据对离心后上清中蛋白的检测方法不同，CETSA 技术发展出如下几种：基于免疫印迹（Western-Blot，图2A）进行检测的 WB-CETSA，主要用于对检测特定靶蛋白和化合物的结合，需要有靶蛋白的抗体。基于质谱（图2B/2C）的 MS-CETSA 方法利用 MS 对 CETSA 中的可溶性蛋白进行分子量的测定，再通过蛋白数据库分析该蛋白，MS-CETSA 现已被用于识别各种药物的未知靶点,提供了一个可同时观察由化合物介导的数千种蛋白质稳定性改变的方法。

图2 不同检测方法的 CETSA 技术平台

2.CETSA  主要实验步骤

动物和细胞给药处理后进行裂解。

离心后取上清裂解液进行梯度或恒温加热。

离心去除加热变性沉淀的蛋白。

通过 western blot 检测并量化靶蛋白，用 graphpad 绘制 CETSA 溶解曲线（CETSA melt curve）。

图3 BLI 技术测定三种分子胶 (4L10, 8C10, and 7E4) (小分子化合物) 分别与 P53 蛋白、USP7 蛋白之间的亲和力

需提供材料：

细胞、一抗，具体项目详细沟通确定

实验周期：

材料到之后一个月之内。

3.CETSA  应用案例

案例一：小分子 YK5、YK198、VER、MKT 分别对蛋白 HSC70、HSP70、HSP90α、HSP90β、HSP110 热稳定性的影响 (Nature Communications)

案例二：farrerol 对 UCHL3 热稳定性的影响(a,b)；farrerol 与 UCHL3中的氨基酸残基(K187) 结合 (c,d)(Nature Communications)

案例三：化合物 CS 对蛋白 NPC2 热稳定性的影响(Nature Communications)