RIP RNA结合蛋白免疫共沉淀

1. 技术简介

RIP，全称为 RNA免疫共沉淀，是一种专门用于研究 RNA结合蛋白与其体内靶RNA分子相互作用 的强大技术。RIP技术的核心原理与ChIP非常相似，都是基于 抗体-抗原的特异性结合。利用针对目标RNA结合蛋白的特异性抗体，在细胞裂解液中，将 该蛋白质及其在体内自然结合的所有RNA分子 一起免疫沉淀下来。随后，通过分离和纯化这些RNA，并进行鉴定与分析，从而揭示该蛋白质在体内直接结合了哪些RNA。

2. 实验流程：

1. 细胞裂解

   • 使用温和的裂解液裂解细胞，释放细胞内容物，同时尽量保持蛋白质-RNA复合物的天然结构，避免非特异性结合。

2. 免疫沉淀

   • 这是最关键的步骤。将细胞裂解液与预先结合在磁珠上的目标RBP的特异性抗体共同孵育。

   • 抗体特异性地捕获目标RBP，而与该RBP结合的RNA也随之被“共沉淀”下来。

   • 通过严格的洗涤步骤，去除非特异性结合的RNA和蛋白质。

3. RNA纯化

   • 向免疫沉淀复合物中加入蛋白酶K，消化掉蛋白质（包括抗体和RBP本身），从而释放出结合的RNA片段。

   • 使用常规的RNA提取方法（如酚氯仿法或硅胶柱）纯化得到RNA。

4. 下游分析

   • 纯化后的RNA就是“与目标RBP结合的RNA库”，可以通过多种技术进行分析：

     • RT-qPCR（逆转录实时定量PCR）：如果已有候选的靶RNA（例如某个特定的mRNA或lncRNA），可以使用特异性引物进行定量分析，验证RBP是否与该RNA结合。

     • 高通量测序（RIP-seq）：这是目前最主流和强大的方法。将RIP-RNA构建文库并进行高通量测序，可以无偏倚地、全面地鉴定出目标RBP在整個转录组范围内的所有结合RNA。

3. 主要应用

RIP技术是研究RNA结合蛋白功能的基石，主要用于：

• 鉴定RBP的靶RNA：发现一个新的RBP具体调控哪些mRNA、lncRNA、miRNA等。

• 研究转录后调控：揭示RBP如何通过结合mRNA来影响其稳定性、剪接、定位和翻译。

• 探索非编码RNA的功能：研究某些lncRNA或circRNA是通过与哪些RBP相互作用来行使功能的。

• 揭示疾病机制：许多疾病（如癌症、神经退行性疾病）与RBP功能失常有关，RIP可以帮助找出异常的RBP-RNA相互作用网络。

4. 技术优势

• 体内研究：在接近生理状态的条件下捕获天然的RBP-RNA相互作用。

• 高通量：特别是与测序结合（RIP-seq/CLIP-seq），可以无偏倚地发现所有结合靶点。

• 特异性：使用高质量抗体时，可以特异性地富集目标RBP的结合RNA。