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蛋白质免疫印迹服务(WB)(实时荧光定量PCR、免疫共沉淀(Co-IP)、原位杂交、全基因合成、引物合成、基因测序、DNA/总RNA/质粒提取、分子克隆与质粒载体构建、ELISA(酶联免疫吸附法)技术等) 威斯腾生物,让科研更简单!

蛋白质免疫印迹服务(WB)(实时荧光定量PCR、免疫共沉淀(Co-IP)、原位杂交、全基因合成、引物合成、基因测序、DNA/总RNA/质粒提取、分子克隆与质粒载体构建、ELISA(酶联免疫吸附法)技术等)    威斯腾生物,让科研更简单!
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供应商信息

威斯腾生物
商家诚信度:
成立时间:2007
入驻丁香通年限:8年
商家等级:金牌客户
产品信息完整度:50%
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电话:400-675-6758

地址:重庆市九龙坡区二郎创业大道高科创业园D栋2层

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产品详情

简介: 实验技术服务
提供商: 威斯腾生物
服务名称: 蛋白质免疫印迹服务
地区: 全国

一、简介:免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting),它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。

二、主要实验步骤如下: 

1. 蛋白质抽提       2. 蛋白质定量             3. 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)  

4. 蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜          5. 膜的封闭和抗体孵育          6. 结果检测

7. 数据分析                                                            8. 提供实验报告

三、仪器与试剂

1.仪器

高速组织捣碎机:SWISS KINEMATIC Ltd. Co(型号:PT1600E)

电泳仪:北京六一仪器厂(型号:DYY-8C)

电泳槽:北京六一仪器厂(型号:DYCZ-24D)    

转印槽:北京六一仪器厂(型号:DYCZ-40D)

低温高速离心机:湖南湘仪公司(型号:H2050R)

超低温冰箱:美国FORMA公司(型号:702)

分光光度计:上海分析仪器总厂(型号:721)

脱色摇床:上海琪特分析仪器有限公司(型号:STS-2)

四、操作流程

1样品准备

1)分别取大约200mg组织加入液氮碾磨成粉末状,按每200mg组织加900μl上样Buffer(无溴酚蓝)和100ul 10mg/ml PMSF,混匀,玻璃匀浆器冰点匀浆

2)4℃,12000rpm离心10min

3)取上清夜-70℃冻存24hr

5)4℃12000rpm再次离心10min,取上清分装,一份用于定蛋白,另一份加入溴酚蓝(0.1%(W/V))后于100℃加热4min,后于-20℃保存待用。

2定蛋白及计算电泳上样量

根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量,电泳上样量定为40ug

3电泳

1)安装好电泳装置

2)根据不同的指标配制相应浓度的分离胶,灌胶约3/5体积,液封(<10%用0.1%SDS,>10%用异丙醇)

3)30min后,待凝后倾去封液

4)配5%的浓缩胶,灌胶至距平板顶部2mm处,插入梳子, 30min后,待凝后拔出梳子,用去离子水清洗加样孔,用滤纸吸干

5)上样:各样品取50ug上样,marker取10μl上样(上样前需按说明书进行预处理)

6)缓慢加入内、外槽缓冲液,接通电源,90v电泳至指示剂进入分离胶后,调电压至150V继续电泳

7)当指示剂距平板底端1cm处时停止电泳

4 转膜及检测

1)准备2个Φ12cm的平面皿,一个装去离子水浸泡NC膜20min,另一装转移缓冲液浸泡海绵和滤纸20min

2)取下胶,切除浓缩胶部分后,将分离胶浸入转移缓冲液中约5min

3)按顺序安装好转膜装置(黑色板-海绵-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维膜-三层滤纸-海绵-红色板)

4)完全排除气泡,4℃,100mA转膜2hr。

5)倾去转膜缓冲液,拆除转膜装置,将硝酸纤维膜放入丽春红中摇床染色15min,用去离子水清洗至能看到条带,后用铅笔标出marker位置,再用去离子水震荡以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右

6)将膜转移至另一容器中,用5%脱脂奶粉封闭, 4℃过夜

7)将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的一抗

8)37℃摇床孵育约2hr

9)PBST洗涤4次,每次5min

10)将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的二抗,37℃摇床孵育约30min

11)PBST洗涤4次,每次5min

12)将膜转移至尽可能小的容器中并加入BCIP/NBT底物,室温孵育30min

13)取出NC膜,用蒸馏水漂洗后晾干

14)扫描及分析

五、服务要求

  • 样本要求:组织样品,每份样本约250-500mg,新鲜或正确保存的组织。细胞样本:每份样本:1*10 6-1*10 7细胞数。
  • 客户提供有效的一抗,(国产抗体一般不接纳) 一抗自备或代购。
  • 客户提供欲检测目的蛋白的详细背景资料。以及提供样本的种属,类型。

六、结果提供

  • 目的蛋白实验图片。
  • 灰度分析结果。(免费分析)
  • 内参结果。(免费跑胶)
  • 详细的实验步骤。
  • 免费提供蛋白样本保存液。
蛋白结果图:
 

灰度分析:


柱状图:

七、完成时间:

接受样本后,1月以内。

八、注意事项:

1、客户要确保模型建造的成功性。

2、客户要确保抗体的有效性。

3、如要加快的客户可以和我们联系沟通。

4、收费标准:以每张膜8个样本收费,不足8个样本的按8个样本收费)

九、服务流程:
1、 讨论分析实验方案
2、 确定服务内容
3、 签订服务合同
4、 进行实验,定期向客户反馈
5、 整理实验报告
6、 完成合同内容
7、 后续实验服务,进一步合作


分子诊断、病理诊断、药效学评价、毒理学实验、细胞药筛、动物建模、PDX模型、CRISPR/Cas9基因编辑、病理检测、基因芯片、蛋白组学、代谢组学、高通量测序、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务!
【全国免费热线】:400-675-6758
【电话】 023-65316016,023-65316556
【邮箱】 china-western@163.com
【官网网址】www.cqwestern.com
【地址】 重庆市高新区二郎创业大道高科创业园 D 栋 2 楼

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 凝胶迁移或电泳迁移率(EMSA)凝胶迁移或电泳迁移(EMSA)原理:凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。主要仪器:高速组织捣碎机: SWISS KINEMATIC Ltd. Co(型号:PT1600E)电泳仪:北京六一仪器厂(型号:DYY-8C)电泳槽:北京六一仪器厂(型号:DYCZ-24D)转印槽:北京六一仪器厂(型号:DYCZ-40D)低温高速离心机:湖南湘仪公司(型号:H2050R)超低温冰箱:美国FORMA公司(型号:702)分光光度计:上海分析仪器总厂(型号:721)脱色摇床:上海琪特分析仪器有限公司(型号:STS-2)主要试剂:蛋白质预染分子量marker(118,90,48,36,27,20kd):FermentasNC膜:Millipore公司(型号:0.45um)化学发光底物:PIERCE公司电泳类生化试剂均为美国amresco公司产品其他生化试剂为国药集团上海化学试剂公司产品总蛋白测定试剂盒:南京建成生物工程研究所NF-KB探针:由Invitrogen公司合成与标记成像系统:富士FLA-5000全功能激光影像成像系统EMSA实验步骤:1.探针的标记:2、探针的纯化:3、EMSA 胶的配制:4、EMSA结合反应:5、电泳分析:

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