CoIP免疫共沉淀| 免疫共沉淀技术服务

技术简介

蛋白质控制了细胞中的所有生物系统，通常它们不是独立作用，绝大多数蛋白质会与其他蛋白质相互作用，一起参与生命过程。免疫共沉淀是研究蛋白与蛋白互作的一种常用的方法，其原理基于抗原-抗体免疫反应，利用抗体结合于琼脂糖磁珠上的Protein A/G，在蛋白液中加入抗原特异的抗体进行孵育，当抗体免疫沉淀抗原蛋白时，能与抗原蛋白结合的目的蛋白一并被沉淀下来，形成“目标蛋白+抗原蛋白+抗体+Protein A/G”免疫复合物，经免疫印迹或质谱检测互作的蛋白。

实验流程

(1)      每个含细胞的1.5ml EP管中加入预冷的等体积的  IP细胞裂解缓冲液，于冰上裂解10min，混合器上4℃裂解30min；

(2)      12000rpm，4℃离心10min，取50ul上清作为Input，另取50ul上清于一新的1.5ml EP管中，用于Co-IP实验；

(3)      取适量Anti-Flag磁珠，用PBST洗3次，再用PBS洗一次，将上步的上清液加入磁珠中，混合器上4℃孵育过夜；

(4)      第二天，将组一放在磁性分离器上，弃上清，用裂解缓冲液洗磁珠3次，再用PBS洗一次，用Flag洗脱缓冲液洗脱15min，磁性分离器分离磁珠与液体，将液体吸到新的1.5ml Ep管中，得到洗脱液。

(5)      将IP产物加Loading buffer混匀沸水煮10min，12000rpm 4℃离心3min，进行Western Blot。