Western blot蛋白质免疫印迹，检测蛋白表达

1. 技术简介

Western Blot，又称为蛋白质免疫印迹，是分子生物学、生物化学和细胞生物学领域中用于特异性检测特定蛋白质在复杂生物样品中的表达水平、存在与否及分子量大小 的经典且必备的实验技术。其核心原理基于以下三个关键步骤：

1. SDS-PAGE 凝胶电泳：根据蛋白质的分子量大小，在凝胶中进行分离。

2. 转膜：将分离后的蛋白质从凝胶原位、定量地转移到一种固相支持物（如PVDF膜或NC膜）上。

3. 免疫学检测：利用抗原-抗体特异性反应，通过针对目标蛋白的特异性一抗和带有标记的二抗，对固定在膜上的靶蛋白进行可视化检测。

 

2. 实验流程

一个完整的Western Blot实验通常需要1-2天，包含以下关键步骤：

1. 样品制备

• 从细胞或组织中提取总蛋白，使用裂解液（如RIPA缓冲液）并加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以防止蛋白降解和去修饰。

• 通过加热（通常95-100°C，5分钟）使蛋白质在SDS和β-巯基乙醇存在下充分变性、解聚，并带上均匀的负电荷。

2. SDS-PAGE 凝胶电泳

• SDS-PAGE：SDS-PAGE凝胶电泳。

• 目的：根据分子量分离蛋白质。SDS使所有蛋白质带负电，电荷量与分子量成正比，掩盖了蛋白质原有的电荷差异。

• 过程：将变性的蛋白质样品加入凝胶的加样孔中，在电场作用下，小分子量蛋白质迁移得快，大分子量蛋白质迁移得慢，从而在凝胶中分离成不同的条带。

3. 转膜

• 目的：将凝胶中分离的蛋白质条带转移到固相膜上，以便进行免疫检测。

• 方法：最常用的是湿式转印法。将凝胶和膜做成“三明治”结构，置于转印缓冲液中，在电场作用下，蛋白质从凝胶中垂直移动并不可逆地结合到膜上。

4. 封闭

• 目的：用非特异性蛋白质（如脱脂牛奶或BSA）覆盖膜上未结合蛋白质的空白区域，以防止抗体与膜发生非特异性结合，从而降低背景噪音。

• 过程：将膜在封闭液中室温孵育1小时。

5. 抗体孵育

• 一抗孵育：将膜与针对目标蛋白的特异性一抗溶液共同孵育（室温1-2小时或4°C过夜）。一抗会特异性结合到其对应的靶蛋白上。

• 洗涤：洗去未结合的非特异性一抗。

• 二抗孵育：将膜与针对一抗种属来源的、连接有报告酶（最常用辣根过氧化物酶HRP）的二抗溶液共同孵育（室温1小时左右）。二抗会特异性结合在一抗上。

6. 化学发光与显影

• 原理：当在膜上加入HRP的底物化学发光液（如Luminol）时，HRP会催化底物发生氧化反应并产生荧光。

• 检测：在暗室中，将X光胶片压在膜上进行曝光，或者使用化学发光成像系统直接捕获荧光信号。信号强度在一定范围内与靶蛋白的量成正比。

7. 数据分析

• 通过分析条带的灰度值进行半定量。

• 使用内参（如GAPDH， β-actin， Tubulin等看家蛋白）对目标条带进行标准化，以校正上样量的误差。

• 最终结果表示为目标蛋白相对于对照组的相对表达量。

 

3. 技术应用

Western Blot是生物医学研究的基石技术，广泛应用于：

• 检测特定蛋白质的表达水平：比较不同样品（如正常与病变组织、处理与未处理细胞）中目标蛋白的表达差异。

• 蛋白质翻译后修饰研究：使用特异性抗体检测蛋白质的磷酸化、乙酰化、糖基化等修饰水平。

• 抗体特异性验证：验证新制备的抗体的有效性和特异性。

• 蛋白质相互作用研究的后续验证：作为Co-IP或Pull-down实验的下游步骤，验证相互作用的蛋白质。

 

4. 技术优势

• 特异性高：依赖于抗原-抗体的高亲和力与特异性结合。

• 半定量：可以比较不同样品中同一蛋白的相对含量。

• 提供分子量信息：通过与预染蛋白Marker对比，可以估算目标蛋白的分子量，并检测是否存在剪接体或降解产物。

• 灵敏度高：可检测低至皮克级别的蛋白质。