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- 通过细胞系移植、基因工程或患者组织异种移植等方式，在实验动物体内模拟人类前列腺癌发生、发展及转移过程的实验研究工具
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- 2025年12月19日
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北京百奥思科生物医学技术有限公司
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前列腺癌动物模型
前列腺癌（prostate cancer，PCa）是全世界范围内男性发病率最高的恶性肿瘤之一，其在亚洲国家已经成为男性最常见的恶性肿瘤。前列腺癌是指发生于前列腺腺体的恶性肿瘤，是前列腺腺泡细胞异常无序生长的结果，常起源于前列腺的背侧叶。
早期前列腺癌可以通过手术和放疗实现有效治疗，进展期前列腺癌发生远处转移的概率可高达70%，预后较差，其中骨是前列腺癌最常见的转移部位。深入探究前列腺癌的恶性生物学特性及其骨转移的机制，对于寻找潜在治疗方法具有至关重要的意义。目前研究表明，肿瘤转移主要通过复杂的转移级联反应过程实现。
众所周知，利用细胞悬液注射方式构建前列腺癌皮下或原位移植瘤动物模型取得成功，其操作简单、易学。然而，这种方式存在细胞悬液渗漏、存活率低、成瘤率不稳定、成瘤持续时间长等局限性，容易引起移植瘤与原肿瘤内环境“失真”。
细胞膜片技术是近年来发展起来的一种新型组织工程技术，该技术无需胰酶消化和添加支架材料，连续体外培养形成膜片状组织。细胞膜片技术能够完整保留细胞外基质（extracellular matrix，ECM），保留细胞生长的微环境和生长因子，其组织结构类似于天然组织。因此，细胞膜片技术已成为当前再生医学和组织工程领域的研究热点，已被应用于泌尿系统修复重建，包括膀胱和尿道。肿瘤细胞膜片是通过ECM黏附形成的，可形成多层次结构，而且具备一定力学强度，使得肿瘤细胞膜片用于移植瘤成为可能。
具体实验方法
1、前列腺癌DU145细胞膜片培养
人前列腺癌细胞系DU145复苏后，重悬在含10%FBS、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱内继续培养，每2~3d更换1次培养基。为促进细胞黏附和细胞膜片形成，预先以500μg/mL鼠尾胶原蛋白Ⅰ型包被35mm温度敏感性细胞培养皿，在4℃的避风条件下保存过夜。当培养DU145细胞达到95%融合时，用0.5%胰酶消化，1000r/min离心5min（离心半径为15cm），细胞重悬，计数后接种至包被培养皿中连续培养，每2d换液1次，连续培养7d即可成膜，于20℃培养15min预冷后可收获完整前列腺癌DU145细胞膜片。
2、前列腺癌DU145细胞膜片的鉴定
前列腺癌DU145细胞膜片用4%多-聚甲醛-溶液固定，石蜡包埋，切片，行HE染色。同时，采用免疫组织化学染色观察细胞膜片特异性蛋白E-cadherin、vimentin和胶原纤维，0.5%Triton-X100破膜，1%牛血清白蛋白常温封闭切片30min，然后分别用E-cadherin（1∶500）、vimentin（1∶500）和Ⅰ型胶原免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）兔抗小鼠抗体（1∶500）温育，4 ℃处理过夜。用PBS洗涤后，将切片与辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）标记山羊抗兔IgG抗体（1∶1000）室温温育1 h，二氨基联-苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色，苏木-精复染，在正置显微镜下观察。
3、细胞膜片皮下移植成瘤
选用BALB/c裸鼠，预先以0.5%胰酶消化单张细胞膜片，1000 r/min离心5min（离心半径为15cm），重悬后计数单张膜片细胞数量，约2×106个。将单张细胞膜片与培养液混合，体积100μL，注射于裸鼠左背部近前肢皮下组织，注射后轻压注射点约30s。
4、皮下移植瘤测量
从移植1周起，每3 d观察裸鼠生存及皮下移植瘤的情况，移植4周后处死实验动物，剥离皮下移植瘤，连带部分周围组织，并用标尺测量移植瘤的最大直径（a）和最小直径（b），肿瘤体积计算公式：V= a×b2×π/6。
5、体内移植瘤的组织学分析
用4%多-聚甲醛-溶液固定移植瘤，石蜡包埋，切片5μm，行HE染色。采用免疫组织化学染色观察血管标志物CD31的表达情况，0.5%Triton-X100破膜，1%BSA常温封闭切片30min，然后分别用CD31兔抗小鼠抗体（1∶500）温育，4 ℃处理过夜。用PBS洗涤后，将切片与HRP标记山羊抗兔IgG抗体（1∶1 000）室温温育，DAB染色，苏木-精复染，在正置显微镜下观察。同时，根据说明书流程，利用马松三色染色试剂盒观察移植瘤中的胶原蛋白表达情况，其中胶原纤维组织呈蓝色。
6、全身转移情况观察
皮下注射移植4周后，处理裸小鼠，解剖前列腺癌常见的转移脏器，如移植附近前肢骨、肺和肝脏，大体观察上述脏器有无结节，并进行H-E染色，评估在骨、肺和肝脏等全身重要脏器的转移情况。
优势
移植瘤组织中微血管密度（microvascular density，MVD）明显较高，且胶原纤维含量丰富，能为细胞膜片中保留ECM和活性因子，促进血管再生。移植瘤从宿主组织中获得了充足氧气和营养物质，成瘤时间缩短，细胞紧密连接，空洞较少，肿瘤浸润周围结缔肌肉组织，并向组织内新形成的血管扩张。
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