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- 文献和实验
- 技术资料
- 提供商：
芳景生物
- 服务名称：
CRISPR Indel
CRISPR Indel
技术优势：
◉适用性广泛：小范围基因编辑，避免敲除对附近相关基因造成影响
◉敲除效率高：针对较难敲除的基因或基因组区域有更好的效果
局限性与解决方案：
◉局限性：可能产生新的未知功能蛋白，对基因功能研究造成表型干扰
◉解决方案：芳景生物可根据客户需求，获取多个移码突变基因型，以减少可能得新蛋白对研究的干扰。
| CRISPR indel(one target) | ||
| 实验步骤 | 内容 | 周期(周) |
| Target测序 | 1.方法：PCR测序 2.目的：确定注射果蝇品系的靶序列，确保gRNA序列正确并进行有效切割 |
1 |
| gRNA和cas9-mRNA合成制备 | 1.gRNA设计：一个靶位点设计两个gRNA 2.gRNA合成：T7体外转录合成 3.cas9-mRNA合成：优化的cas9-DNA质粒为模板，体外转录合成cas9-mRNA |
2 |
| 显微注射 | 1.注射品系：w1118(或客户指定品系) 2.注射样品：gRNA+cas9-mRNA 3.注射胚胎数量：300-400个 |
2 |
| 杂交鉴定和构建稳定品系 | 1.P0果蝇与平衡子杂交，并进行indel测序鉴定 2.阳性P0的子代F1果蝇与平衡子杂交，并进行indel测序鉴定 3.阳性F1的子代F2果蝇与平衡子杂交，并进行indel测序鉴定 4.阳性F2的子代F3果蝇自交构建稳定品系 5.F3的子代F4果蝇自交构建纯合品系，并进行indel测序鉴定 |
8~10 |
| 合计 | 13~15 |
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文献和实验"编辑效率 70%"这句话，不同实验室可能指的是完全不同的东西。有人指的是测到 indel 的细胞比例，有人指的是移码比例，有人指的是 Western 上条带变浅的程度。投稿时被追问"你怎么定义编辑效率"，答不上来的情况并不少见。 先说结论：不存在一种适用于所有场景的检测方法，只有分层级的验证策略。初筛用 Sanger + 序列分解（ICE/TIDE）快速比较几条 gRNA 的优劣；结论性的判定必须用靶位点扩增子 NGS，因为它能同时给出编辑比例、移码比例、框内比例和大片段缺失信息；蛋白层面
。 Target 设计 Target 设计：通常情况下我们仅需要在你的目的位置附近找到 NGG（N 代表任意核苷酸），然后找到其紧邻的上游 20 nt 即可（如上图）。 目的位置的选择：我们绝大部分时候的目的是完全 KO 一个基因，其原理是利用移码突变（CRISPR/Cas 系统诱导产生 indel）。所以我们一般选择距离起始密码子 ATG 下游 200bp 范围内的 exon 区域。另外，通常一个基因往往会转录成 2 个以上的 isoforms，所以请选择尽量
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