ES打靶

1. 技术定义与核心原理

ES打靶（胚胎干细胞基因打靶）是一种利用胚胎干细胞（ES细胞）作为媒介，通过同源重组将外源DNA定点整合至基因组特定位置的基因编辑技术。其核心原理包括：

• 同源重组机制：通过设计同源臂（通常3-5 kb）引导外源DNA与目标基因组位点精确重组。
• 正负筛选系统：使用正筛选标记（如抗性基因）筛选成功重组的细胞，负筛选标记（如DTA毒素基因）剔除随机插入的细胞，提高精准度。
• 胚胎干细胞全能性：ES细胞具有分化成所有组织器官的能力，修饰后的ES细胞可发育为嵌合体小鼠，并将基因修饰遗传给后代。

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2. 技术流程与周期

传统流程（7-12个月）：

1. 载体构建：设计含同源臂的载体，大片段插入需BAC载体（支持100-300 kb敲入）。
2. ES细胞转染与筛选：电转载体至ES细胞（常用129S6/SvEvTac或C57BL/6N品系），药物筛选阳性克隆。
   
    
3. 嵌合体制备：将修饰后的ES细胞注入囊胚，发育成嵌合体小鼠（嵌合率20-70%）。
4. 种系传递：嵌合体与野生型小鼠交配，获得杂合子后代。

技术革新缩短周期：

• TurboKnockout技术（赛业生物）：
  • 跨越“嵌合体”阶段：通过特定显微注射技术，使ES细胞100%替代内源细胞，无需嵌合体交配。
  • 自删除抗性基因（如Neo） ：避免额外交配步骤，减少两代繁育时间。
  • 周期缩短至6-8个月（传统需10-12个月）。
• EPS细胞打靶（维通达）：
  • 效率提升10-100倍，单细胞注入即可生成100%嵌合体，省去3个月种系传递。

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3. 优势与适用场景

核心优势：

• 精准无脱靶：同源重组机制确保编辑精确性，是基因编辑的“金标准”。
• 支持复杂修饰：适用于大片段敲入、条件性敲除（cKO）、点突变（PM）、KO-first模型、二次打靶及人源化模型等。
• 稳定性与可遗传性：修饰效果稳定，可通过生殖系遗传。

对比CRISPR技术：

指标	ES打靶	CRISPR
精准度	高（无脱靶）	存在脱靶风险
适用性	大片段/复杂编辑	简单编辑
周期	6-12个月（传统）	更短（交付快约4个月）
成本	较高	较低
知识产权	TurboKnockout无专利困扰	部分技术受专利限制

注：的柱状图显示ES打靶在特定指标（可能为精准度或复杂度）评分（9.5）高于CRISPR（7）。

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4. 局限性

• 传统缺陷：耗时、低效、成本高，仅适用于小鼠模型。
• 技术依赖：需成熟ES细胞培养体系，操作复杂。