质粒改造

一、改造目的与原则

1. 目的：

   • 插入功能元件：如外源基因（报告基因、抗性标记）、启动子、终止子或多克隆位点（MCS），以增强表达或筛选能力 。
   • 删除冗余序列：移除非必需区段（如旧抗性基因），减小质粒大小，提高转化效率和装载能力 。
   • 修饰现有序列：包括启动子替换、点突变（如密码子优化）或复制子调整（改变拷贝数） 。
   • 安全性改造：例如农杆菌Ti质粒需去除致癌基因，保留T-DNA转移功能 。

2. 基本原则：

   • 减小分子量：删除非复制必需区段，提升载体容纳外源DNA的能力 。
   • 优化酶切位点：引入单一限制性酶切位点（避免重复），便于定向克隆 。
   • 添加筛选标记：如抗生素抗性基因（卡那霉素、氨苄青霉素）或报告基因（GFP、GUS），便于阳性克隆筛选 。

二、常用改造方法

1. 传统酶切-连接法

• 步骤：用限制性内切酶（如Xba I/Sac I）双酶切质粒和目的片段，T4 DNA连接酶连接 。
• 适用场景：简单插入或替换，需依赖特定酶切位点 。
• 优化：碱性磷酸酶处理载体防止自连，双酶切确保方向正确 。

2. 无缝克隆技术

• Golden Gate克隆：利用IIS型限制酶（如Bbs I）产生粘性末端，实现多片段定向组装（可同时连接10个以上片段） 。
• Gibson Assembly：依赖5'端同源臂（15-40 bp）重组，无需酶切位点 。
• 优势：避免引入额外序列，适合大片段或复杂构建 。

3. CRISPR/Cas9编辑

• 设计sgRNA靶向质粒特定区域，Cas9切割后利用宿主修复机制引入突变 。
• 应用：大片段删除或精确点突变，不依赖酶切位点 。

4. 定点突变

• 重叠延伸PCR：通过引物引入突变位点，替换原片段 。
• QuikChange突变：全质粒PCR扩增后，用DpnI消化模板质粒 。

三、实验流程与优化

1. 操作流程：

   • 制备线性化载体：酶切或PCR扩增（含同源臂） 。
   • 制备插入片段：PCR扩增目标基因（引物含酶切位点/同源臂），纯化去除杂质 。
   • 连接/重组：传统连接（16℃过夜）或无缝克隆（50℃ 1小时） 。
   • 转化与筛选：化学转化/电转化感受态细胞，抗生素或蓝白斑筛选 。
   • 验证：菌落PCR、酶切分析、测序（Sanger或高通量测序） 。

2. 优化策略：

   • 提高效率：优化插入片段与载体摩尔比（1:3~3:1），延长同源臂（30-40 bp），使用高保真DNA聚合酶 。
   • 降低背景：双抗生素系统筛选，重组缺陷型菌株提升稳定性 。