基因型鉴定

一、技术定义与核心目标

动物基因型鉴定是通过分子生物学手段检测个体特定基因位点的遗传组成（如野生型、突变型、转基因插入状态），以确定其遗传特征的技术。核心目标包括：

1. 确认基因修饰类型：区分转基因、基因敲除/敲入、点突变等模型。
2. 鉴定遗传状态：判定纯合子（-/-）、杂合子（+/-）或野生型（+/+）。
3. 评估表达水平：验证目标基因的转录或蛋白表达是否与预期一致。

生物学意义：为遗传育种、疾病模型构建及功能研究提供分子层面的精准依据。

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二、核心鉴定方法及技术流程

1. PCR + 凝胶电泳（主流方法）

• 原理：针对目标基因设计特异性引物，扩增基因组DNA中的差异片段，通过电泳条带大小判断基因型（图1）。
  关键引物设计策略：

  模型类型	引物设计	检测目标
  基因敲除（KO）	野生型引物：位于敲除序列内；突变型引物：位于同源臂外或抗性基因内（如Neo）	区分纯合/杂合/野生
  基因敲入（KI）	引物跨过插入位点，扩增片段大小差异需>100bp	确认外源序列整合位置
  转基因插入	引物结合外源基因（如GFP），需设置内参引物（如β-actin）	检测随机插入是否存在

• 流程（以小鼠为例）：

  1. DNA提取：剪尾/采血→蛋白酶K消化→酚氯仿抽提。
  2. PCR扩增：
     • 反应体系：模板DNA + 特异性引物 + dNTPs + Taq酶。
     • 程序：95℃变性→55-60℃退火→72℃延伸（30-35循环）。
  3. 电泳分析：
     • 琼脂糖凝胶（1.5-2%）电泳，对比Marker判断条带大小（图2）。
     • 结果判读：
       • 野生型（+/+）：仅野生条带（如500bp）。
       • 杂合子（+/-）：野生+突变条带（500bp + 700bp）。
       • 纯合子（-/-）：仅突变条带（700bp）。

! PCR电泳结果示意图（野生型、杂合子、纯合子）

2. Southern Blot（金标准验证）

• 原理：基因组DNA酶切→电泳分离→转膜→标记探针杂交，检测基因拷贝数及整合完整性。
• 适用场景：
  • 验证转基因拷贝数及是否重排/缺失（PCR无法检测）。
  • 鉴定随机插入位点（需结合FISH技术）。
• 局限性：耗时长（>3天）、需大量DNA（>10μg）、技术门槛高。

3. 实时定量PCR（RT-qPCR）

• 功能：
  • 快速定量转基因mRNA表达水平。
  • 辅助判断基因敲除效率（目标基因表达量显著降低）。
• 优势：灵敏度高、可自动化。

4. 荧光原位杂交（FISH）

• 应用：
  • 直接观察转基因在染色体上的整合位置。
  • 检测染色体重排或局部缺失（如CRISPR脱靶效应）。

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三、基因编辑动物模型的特殊鉴定策略

CRISPR/Cas9模型（如囊性纤维化猪）

1. 细胞阶段鉴定：
   • 电转递送CRISPR组件至原代细胞→G418筛选阳性克隆→PCR+Sanger测序验证编辑效率。
2. 胚胎/个体鉴定：
   • 核移植后电融合形成囊胚→移植至代孕母体→出生后剪尾PCR+测序。
   • 关键指标：目标基因编辑效率、脱靶效应检测。

胚胎干细胞系构建（如内源标签融合）

• 流程：
  • 电转Cas9/sgRNA + 同源重组载体至干细胞（如Flip08细胞）。
  • 药物筛选（G418）→单克隆扩增→PCR+测序验证标签整合位点。