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- 2025年12月17日
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伊莱博生物科技（上海）有限公司
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电转
一、技术原理与生物学基础
1. 电穿孔的物理机制
- 膜电位改变：短时高压电场（通常500–4000 V/cm）使细胞膜磷脂双层发生极化，形成亲水性临时孔隙（直径≈10 nm），持续时间毫秒级。
- 分子递送机制：带负电的DNA/RNA在电场驱动下以电泳方式穿过孔隙进入胞质，后续依赖细胞自身机制扩散至核内（核膜无有效电场作用，故“核电转”为伪概念）。
- 可逆性与安全性：
- 可逆电穿孔：低强度脉冲后膜修复完整，细胞存活率>90%。
- 不可逆电穿孔：高强度脉冲致膜结构永久破坏，用于肿瘤消融（非基因操作）。
2. 关键参数优化
| 参数 | 作用 | 典型值 |
|---|---|---|
| 电场强度 | 决定孔径大小与细胞存活率 | 哺乳细胞：100–500 V/cm |
| 脉冲时长 | 影响分子渗透深度 | 1–10 ms |
| 脉冲波形 | 方波（均一渗透）vs 指数衰减波（能量渐变） | 方波为主 |
| 缓冲液离子浓度 | 高导电性介质增强电流效率，但需避免电解损伤 | 低盐溶液（如Opti-MEM） |
注：物种差异性显著，如小鼠受精卵需30V脉冲（3ms时长+97ms间隔，7循环）。
二、标准化操作流程
1. 体外电转（以受精卵为例）
- 样本制备：
- 收集受精卵（体内/体外受精），用低盐缓冲液（如Opti-MEM）清洗3次，去除血清干扰。
- 电转体系构建：
- 将受精卵与目标分子（如CRISPR/Cas9核糖核蛋白）混合，置于电转杯或定制电极槽（如LF501PT1-10铂金电极）。
- 脉冲施加：
- 优化参数（如小鼠：30V，3ms脉冲×7循环），脉冲间隔97ms避免过热。
- 复苏培养：
- 电转后立即用M2培养基清洗，转入KSOM培养液恢复，37℃/5% CO₂孵育至囊胚期。
2. 体内电转革新：i-GONAD技术
- 原理：跳过体外操作，直接对孕鼠输卵管壶腹部施加电场，转染体内受精卵。
- 流程：
- 孕鼠麻醉后暴露输卵管。
- 注入外源DNA溶液至壶腹部。
- 定制电极夹住输卵管施放电脉冲（参数同体外）。
- 优势：
- 避免体外培养损伤，胚胎存活率提升20%。
- 已成功应用于小鼠、大鼠，潜力扩展至猪、猴。
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文献和实验（如 Cas9）（图 2）,Cas9 能够将该序列进行切除（图 3）。正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR/Cas9 技术应运而生，从而使科学家们利用 RNA 引导 Cas9 核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点（如 NHEJ 非同源性末端接合) (图 4) 进行修饰。为什么要电转？CRISPR 革命已经开始，将 CRISPR 结构导入特定细胞 (如干细胞、神经细胞、造血细胞、受精卵, 等等) 用普通地方法往往很困难。电穿孔技术可使这些细胞在精确的电脉冲作用下，在细胞膜上形成瞬时的空隙
北京生物研究所的团队优化了 CAR-T 生产的电转染条件，可以在 6 天内生产出对肿瘤细胞有正常杀伤效果的 CAR-T 细胞。 无论做基础研究还是在临床的免疫治疗中，拥有一套关于人原代T细胞工程的有效基因转导系统是十分重要的。假病毒系统和电转染是目前最流行的基因转导策略，但与病毒颗粒介导的方法相比，电转染理论上更安全，因为它没有使转导的基因整合到宿主基因组上。此外，电转导具有方便、快捷的有点，使其更有吸引力。在此，北京生物研究所的研究者开发了一种用于生产嵌合抗原受体(CAR)-T 细胞的电转
一、电转化感受态细胞的制备1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照）2.37℃，220rpm，培养14-16个小时。3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。5.弃上清，离心
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