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- AAV-Barcode快速筛选病毒定制服务（qPCR法筛选）
- 武汉
- 2025年12月14日
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- 提供商：
BrainVTA
- 服务名称：
AAV-Barcode快速筛选病毒定制服务（qPCR法筛选）
AAV衣壳和表达框元件快速筛选
腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）因其出色的组织特异性、低免疫原性、安全性和稳定性，已成为基因治疗领域极具潜力的病毒载体。由于不同衣壳AAV在组织亲嗜性上各有差异，因此选择合适的衣壳对于基因治疗效果的优化至关重要。此外，AAV表达框的优化也是决定基因治疗成败的核心环节之一。然而，传统的AAV衣壳筛选与表达框优化耗时费力、成本高昂，受实验批次间影响较大，导致结果的不确定性，从而难以实现系统性和标准化的优化流程。
因此，劲帆医药专为AAV设计了一段独特的DNA序列（Barcode），通过基因工程插至AAV基因组中，同时筛选针对各Barcode且经过扩增效率一致性验证的qPCR引物，通过qPCR检测Barcode表达水平来量化不同衣壳AAV的感染效率及表达框效能，为AAV优化提供标准化、高通量的解决方案。
优势
检测方法
1. AAV衣壳筛选
将候选AAV衣壳1:1（每种衣壳含有不同barcode）混合感染293T细胞或小鼠，取细胞或目标组织样并提取总RNA，通过qPCR检测不同衣壳AAVbarcode的表达水平，筛选最佳AAV衣壳。
2. AAV表达框优化筛选（启动子筛选为例）
将候选启动子（每种启动子对应一种特定的Barcode）与EGFP报告基因使用适合的衣壳AAV载体进行包装，然后将其1:1混合感染293T细胞或小鼠，取细胞或目标组织样并提取总RNA，通过qPCR检测EGFP及各启动子对应Barcode的表达水平，筛选出最佳启动子。
3. RNA提取及qPCR法检测
使用RNA提取试剂盒（需自备）提取细胞或组织样品总RNA，并用逆转录试剂盒（需自备）将1μg RNA逆转录为cDNA，然后通过EGFP及各Barcode引物进行qPCR检测病毒感染后是否表达对应mRNA，模板分别用AAV mix DNA/样品cDNA，反应按下表进行。
|
成分 |
体积（μl） |
|
AAV mix DNA/样品cDNA |
1 |
|
引物 |
0.4 |
|
qPCR mix |
10 |
|
ddH2O |
8.2 |
|
总体积 |
20 |
4. 结果计算及分析
将qPCR实验所得Ct值对应填入下表，并按表中所示计算方式进行计算，最终的占比数值即为AAV mix中不同衣壳病毒相对感染效率，数值越大则表示该种衣壳AAV的感染效率越高/启动子表达效能越高。
|
病毒样品 |
AAV#1/ 启动子#1 |
AAV#2/ 启动子#2 |
AAV#3/ 启动子#3 |
AAV#4/ 启动子#4 |
… |
AAV#9/ 启动子#9 |
AAV mix （总病毒） |
|
引物 |
引物1 |
引物2 |
引物3 |
引物4 |
… |
引物9 |
EGFP引物 |
|
AAV mix DNACt值 |
A |
B |
C |
D |
… |
I |
Y |
|
样品cDNACt值 |
a |
b |
c |
d |
… |
i |
y |
|
效率系数S |
S=(2－A+2－B+2－C+…+2－I)/(2－a+2－b+2－c+…+2－i) |
| |||||
|
相对感染效率 |
2A－a×S |
2B－b×S |
2C－c×S |
2D－d×S |
… |
2I－i×S |
|
产品组分
|
组分 |
内容 |
|
AAV mix |
以EGFP为报告基因，多种含有不同barcode的AAV（可定制） 规格：滴度1E+13vg/ml、体积100µl |
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Primers |
包括：barcode引物、EGFP引物 规格：浓度10µM/µl、体积10µl/Primer |
应用案例
1. 体内注射筛选各组织最佳AAV衣壳：
通过尾静脉注射9种不同衣壳,每种衣壳对应一种特定的Barcode,混合感染C57小鼠，收集小鼠组织并提取总RNA,通过qPCR检测不同衣壳AAV表达水平。实验结果显示，不同组织样本中各衣壳AAV的感染效率排序具有显著组织特异性，其分布特征与预期靶向效率吻合。
2. 感染293T细胞筛选最佳启动子：
采用AAV9系统构建含六种不同启动子(各对应一种特定的Barcode)及EGFP报告基因的重组载体。梯度稀释将病毒分别实施混合感染或单独感染293T细胞系，收集细胞并提取总RNA,通过qPCR检测EGFP报告基因及Barcode表达水平。校正后混合感染中各启动子Barcode表达水平与单独感染EGFP表达水平趋势基本一致，表明该方法能有效去除混合感染的交叉干扰风险，启动子筛选方法可靠性高。
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