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- 2026年01月19日
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稳定细胞株筛选
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上海生博生物医药科技有限公司
常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天。在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β-半乳糖苷酶等来帮助检测。后者外源质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因及蛋白。需要在瞬时转染基础上对靶细胞进行筛选。建立稳定的细胞系，是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。最常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin），常用Hygromycin B、G418和puromycin进行选择性筛选。筛选得到的细胞或者可稳定表达目的蛋白，用于蛋白的扩增和富集；或者得到稳定沉默特定基因的细胞株。
对于有特殊需求的稳定细胞株请参阅生博公司最新推出使用TALENs介导的定点整合稳定细胞株构建服务。
上海生博提供: 载体构建服务，或对已构建好的外源质粒DNA进行稳定筛选。针对质粒DNA的抗性标志，选择相应的药物，并对所需筛选的细胞进行药物测试，选择细胞全部凋亡时药物的最低浓度。瞬时转染或者慢病毒感染细胞后，在适当的药物浓度条件下进行细胞筛选。10-14天后，挑取单克隆，扩增后通过RT-PCR检测mRNA表达情况或客户提供靶基因特异性抗体，上海生博提供Western Blot检测，根据蛋白表达情况，进一步筛选出稳定细胞株。
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参考文献
【1】Grez M, Akgün E, Hilberg F, Ostertag W. Proc Natl Acad Sci. 1990 Dec;87(23): 9202- 9206.
【2】Poeschla E, Corbeau P, Wong-Staal F. Proc Natl Acad Sci. 1996 Oct 5;93(21):11395- 11399.
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文献和实验用慢病毒筛选稳定细胞株，以G418筛选方法为例，筛选出稳定整合Neomycin抗性基因的细胞系。 A 、 G418 抗生素最优浓度筛选 每种细胞对抗生素的敏感性不同，因此，准备建立稳定细胞系之前，需要确定能够在10-14天杀死细胞的最佳浓度。 方法如下 ： 1、将细胞稀释到1000个细胞/mL，接种到24孔板，每孔1ml。 2、接种后第二天在100ug/mL~1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选。3、每隔3天跟换1次培养液，保持G418浓度不变。 4、选择出
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