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上海复百澳生物科技有限公司
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CRISPR 单克隆细胞筛选
CRISPR对目的细胞进行基因编辑后，由于编辑效率和修复机制的问题，多数情况下需要进行单克隆细胞的筛选，将筛选后的单克隆细胞用于后续的实验实验。常规的单克隆细胞获取方法：96孔细胞培养板有限稀释法和用流式细胞仪分选法。
实验步骤
1. 将目的细胞接种于6孔板中至70-80%融合度 ；
2. 待细胞贴壁后，加入puromycin药物进行空细胞致死最低浓度筛选，一般药物浓度梯度设置为 1ug/ml、2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml（终浓度）进行筛选；
3. 药物处理48h 后细胞全部死亡的最低药物浓度即后续稳定株筛选的药物使用终浓度 ；
4. 将目的细胞接种于 6孔板中，待细胞贴壁后进行慢病毒感染，感染后第二天，加入最低浓度的puromycin药物进行筛选，同时做一份空细胞作为对照。显微镜下观察存活细胞中示踪基因的表达（puromycin或GFP）,继续维持培养；
5. 待细胞密度生长至90%时，常规消化后接种于96孔板中，调整接种的细胞密度为1-1.5个/孔 （流式细胞仪分选法，直接上机分选单细胞至96孔板中）；
6. 继续培养两周左右，期间适时补液或换液，待孔板中细胞长至细胞克隆时，挑取阳性细胞克隆至24孔板中扩大培养并检测目的基因的表达（或敲除）；
7. 正确克隆进一步的扩大培养，直至获得需要的细胞量。
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文献和实验篇相关文献相继发表发表 (图 A)，这项技术如同病毒一般广泛又迅速的传播到世界各地，并且随着时间推移，这项技术也出现了许多革新与优化。 CRISPR 序列的生物学功能依然不够明确 1987 年，科学家们首次在大肠杆菌中发现了 CRISPR 基因，并且随后在 40% 的细菌中和 90% 的古细菌体内发现了类似序列。2005 年，CRISPR 序列与抗噬菌体的免疫作用联系起来。整个 CRISPR-Cas9 获得性免疫系统通路大致分为三个步骤：获得 CRISPR 序列-产生
CRISPR-Cas9 全程实操教程：从 gRNA 设计到挑单克隆全程指导
基本原理CRISPR-Cas9 是一种细菌获得性免疫，用于降解入侵的外源 DNA。CRISPR RNA (crRNA) 与转录激活 crRNA (Trans-activating crRNA， tracrRNA) 退火形成的复合物能特异性识别与其互补的基因组序列，引导 Cas9 核酸内切酶在目的片段生成 DNA 双链断裂，如下图所示。通过基因工程手段对 crRNA 和 tracrRNA 进行改造，将其连接在一起得到 sgRNA (single guide RNA)。通过将表达 sgRNA
CRISPR/Cas9 是一种强大的基因组编辑工具，今天我们介绍 CRISPR/Cas9 系统操作。以下操作说明是基于作者冰糖个人实验室操作，仅供参考。 质粒介绍我们使用的是 Feng Zhang 实验室的系统的 pX330 质粒，如下图所示： 酶切系统 37 ℃, 3 hr；Run 1% gel，回收。Elute 到 50 mL H2O。我们利用 BbsI 消化载体形成粘末端，以利于下游 oligo 退火产物的连接；酶切时请充分，且绝对不能加 CIP 处理
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