肺癌抗原Cyfra21-1特异性T细胞定量检测试剂盒

研制方法：

Cyfra21-1是NSCLC最有价值的肿瘤相关抗原之一，也是临床诊断NSCLC以及监测和评估预后复发的一种常用肿瘤标志物。本公司根据Cyfra21-1蛋白的全长氨基酸序列（400aa），通过8种T细胞表位预测数据库，虚拟预测了近两百种被13种优势HLA-A、15种优势HLA-B和14种优势HLA-C分子提呈的Cyfra21-1抗原肽，作为候选表位肽；然后收200余位肺癌患者的新鲜外周血，将PBMC细胞与候选表位肽共培养6小时，通过胞内细胞因子染色和流式分析检测PBMC中被多肽激活而分泌IFN-γ的T细胞数量，筛选在患者体内具有真实免疫原性的AFP抗原T细胞表位肽。然后利用41种表达中国人群优势HLA-A\B\C分子的细胞株阵列进行HLA分子的多肽竞争结合实验，进一步分析每种表位肽的HLA交叉限制性，明确每种表位肽适合的人群广度。

试剂盒的组成：本试剂盒利用本公司筛选所得的37种Cyfra21-1抗原的真实抗原肽组成广谱CD8+ T细胞表位肽库，其中22种抗原肽被13种优势HLA-A分子提呈，23种被15种优势HLA-B分子提呈、13种被14种优势HLA-C分子提呈，且每种抗原肽能被 2-4 种 HLA 分子交叉提呈。这些优势HLA-A、B和C分子的基因总频率分别覆盖95%，71%和93%左右的中国人群。因此，本Cyfra21-1抗原肽库符合中国最广泛人群的HLA-A\B\C基因多态性，具有中国人群普适性，并且具有Cyfra21-1表位的丰富代表性，能检测至少58种Cyfra21-1特异性CD8+ T细胞克隆。将上述37种抗原肽分成2个肽库，组装成ELISPOT试剂盒，定量检测肺癌患者外周血中处于记忆或活化状态、并且具有免疫反应活性的Cyfra21-1特异性CD8+T细胞数量。

试剂盒的临床意义：肺癌抗原Cyfra21-1特异性T细胞功能的定量检测是即时评估免疫治疗效果的精准指标，也是评估其他治疗方法前后患者特异性T细胞免疫功能变化以及判断预后的重要指标。

试剂盒的优点：

1、定量检测具有反应活性的Cyfra21-1特异性T细胞数量，目前市场上没有同类试剂盒。

2、普适性检测，患者不需HLA等位基因分型。所用37种抗原肽遍布Cyfra21-1蛋白的全长序列，能被上述 13 种优势 HLA-A 分子，15种优势HLA-B分子和14种HLA-C分子所提呈，其基因总频率分别覆盖 95%，71%和93%左右的中国人群。因此本试剂盒具有中国人群普适性。

3、真实的抗原肽库，检测58种特异性T细胞克隆。本试剂盒所用的37种Cyfra21-1抗原肽是利用200余位肺癌患者的血标本经T细胞功能实验验证获得的真实抗原肽，能检测至少58种Cyfra21-1特异性CD8+ T细胞克隆的反应活性，能真实反应患者的特异性细胞免疫功能状态。

4、同时分析患者整体T细胞库的反应活性。每份标本设置一个阳性检测孔，有丝分裂素PHA为刺激剂，既做阳性对照，又同时监测肺癌患者整体T细胞库的反应活性，属于临床已开展的淋巴细胞转化功能检测项目。

5、特异性好，灵敏度高，操作相对较简单，不需特殊仪器。ELISPOT是最经典的抗原特异性T细胞检测方法之一，被国内外广大科研工作者所使用和认同。可以在一百万个细胞中检测出一个分泌特定细胞因子的阳性细胞，比流式细胞分析技术更加灵敏。

6、质量可靠，稳定性好，所使用的一抗、二抗和PVDF膜板都是从国外大公司进口。本试剂盒检测活细胞功能，重复性和稳定性都超过国家标准；保质期达5个月。