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- 2026年01月26日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
大量
- 英文名：
干扰稳转细胞系构建
- 保质期：
1年
- 供应商：
瓦兰生物
- 保存条件：
2-8℃
- 规格：
1
干扰稳转细胞系构建
赠送:NC对照细胞系
备注:含QPCR验证
慢病毒感染快速指南
1. 将目的细胞按 30%汇合度接种到 24 孔板，约 3-5×104细胞数/孔，不同细胞因为细胞大小不同细胞数量会不同，快速指南以细胞数量为 5×104为例，加入 500uL 完全培养基进行细胞培养。
2. 接种后 12-20h 感染阴性对照慢病毒（接种细胞至病毒感染细胞时间不宜太长，否则细胞增殖影响细胞密度不利用后期抗性筛选）。
3.加病毒量计算方法：（细胞数×MOI 值/病毒滴度）×103=病毒量（uL），加病毒量见下表。同时加入 Polybrene，每孔加 0.25uL，浓度为 10mg/mL Polybrene，细胞培养液中终浓度为5ug/mL。
4.感染 16-20h 后更换培养基，弃去培养基，每孔加入 500uL 新鲜的培养基。
5.感染后 48-96h 显微镜观察荧光。（注：如果 48h-96h 期间细胞汇合度达到 100%，请及时传代培养）
6.建议将 48 孔板细胞进行传代，传代 12 孔板，后继续观察荧光，根据细胞状态和荧光细胞比例综合判断细胞感染最佳 MOI 值。一般选择细胞生长良好，感染效率 80%左右的感染条件作为最佳感染条件。（注：100%荧光感染不一定为细胞最佳 MOI 值，因为可能会造成细胞慢病毒感染拷贝数太高，影响细胞状态）
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文献和实验这里说的稳转细胞系的构建是指慢病毒转染构建的稳转细胞系，可以构建表达细胞系，也能构建敲降细胞系，经常有人问我什么叫稳转和顺转的区别。瞬转细胞系，一般情况下能够稳定表达最多长一周左右，而稳转细胞系，只要构建成功就能稳定表达，没有时间限制，但是也不是肯定的，一般实验构建的细胞系超过 10 代以后，这个细胞系就有可能不靠谱了。接下来，咱们讲讲稳转细胞系的构建。一般来讲 shRNA 用的是 HIV 病毒，虽然已经经过处理，但是一听这名字也觉得渗人，无论如何保护自己是在实验室永葆青春的基础，所以一定
myskite 将以构建的microRNA质粒稳转至细胞系，有人做过吗，分享一下。 bioenw 我做过miRNA的稳转实验，我们可以进行交流。 版主zhujoker留言: 不要轻易留邮箱以及联系方式。可以站内PM，也不要变相打广告 myskite 我已经构建了pcDNA3.1(+)-premiR的表达载体，正在准备细胞。据说，这个实验，细胞爱死
的转染方法进行细胞转染。包括：磷酸钙转染、脂质体转染、电穿孔转染等。您可以购买市售的商品化转染试剂并且参照供应商说明书进行细胞转染实验。 步骤6 ：观测GFP 荧光和稳定表达细胞系筛选 如果细胞转染成功，并且您使用了带GFP的载体，根据细胞生长速度的不同，在转染后3-5天能在荧光显微镜下观察到细胞发出绿色荧光。请注意，绿色荧光蛋白的表达表明转染细胞成功，不能说明RNA干扰实验成功。 如果您使用了带有真核抗性标签如Neo-R的载体，这时您可以加入合适浓度
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