Millipore-ECL/Immobilon Wester

【原创】暗室实验（化学发光底物检测方法）及Western Blot实验优化方法

暗室实验 暗室实验的操作流程： 1. 新鲜配制1-2ml工作液（A液与B液1:1或1:40混合配制） 2. 进入暗室，在黑暗的条件下，加入1μl未稀释的二抗（HRP连接物） 3. 混合后，可立即在暗室中观察到蓝色光 暗室实验的注意事项： ? 工作液按正确比例混合，且新鲜配制 ? 在暗室中加入二抗 ? 直接使用未稀释的二抗 ? 加入二抗后，立即观察 注：暗室实验可同时检测底物是否有活性，以及二抗是否有活性。 如果暗室实验结果阴性： 更换其它二抗，再次进行

Western 实验步骤

方法也不同，常用的检测系统有化学发光检测（ECL）和化学显色 DAB 检测系统。 化学发光检测（ECL）： 利用 HRP 催化化学发光物质，生成一种不稳定的中间物质，其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带，利用 X 胶片感光 原理，将结果记录下来。 ECL 显色试剂配制：化学发光底物 A 和 B 按照 1：1 比例等体积混匀。 将混合好的显色底物覆盖印迹膜 1-5 min，黑暗条件下观察荧光效果。 在暗室可用放射自显影胶片或化学发光成像系统记录结果 。 如采用放射自显影胶片，曝光几秒

选择WB（Western Blot）底物显色方法的关键

同时存在的情况下发光，因此特别适合在同一膜上对不同的靶蛋白进行多重检测。目前最高检测灵敏度已达到Femto水平，已成为最安全、最灵敏的WB检测方法。在许多研究者的心目中，ECL几乎已经成为化学发光的代名词，一般含有Luminol、H2O2和发光增强剂等物质。发光试剂中的Luminol被HRP和H2O2氧化产生荧光，荧光被发光增强剂增强。 化学发光常见的问题是抗体的浓度过高，所以抗体的量要比规定的稀释量加大，以保证底物不会因为HRP过量而过快用完，导致结果不稳定。