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- 流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物学和医学领域的强大技术，能够快速、准确地分析细胞群体中的多种参数。 在细胞凋亡检测中，Annexin V/PI双染法是一种常用的方法，结合了Annexin V对早期凋亡细胞的敏感性和PI对晚期凋亡及坏死细胞的识别能力，从而能够区分不同阶段的凋亡细胞。
- 天津
- 2026年01月07日
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天津国晟中源科技有限责任公司
- 服务名称：
流式细胞术检测细胞凋亡
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项
流式细胞术检测细胞凋亡
(Annexin V/PI 法）
流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物学和医学领域的强大技术，能够快速、准确地分析细胞群体中的多种参数。
在细胞凋亡检测中，Annexin V/PI双染法是一种常用的方法，结合了Annexin V对早期凋亡细胞的敏感性和PI对晚期凋亡及坏死细胞的识别能力，从而能够区分不同阶段的凋亡细胞。
一、原理：
Annexin V：Annexin V是一种钙依赖的磷脂结合蛋白，对磷脂酰丝氨酸（PS）具有高度亲和力。在细胞凋亡早期，PS会从细胞膜内侧翻转到外侧，这使得Annexin V能够结合到凋亡细胞的表面，作为检测早期凋亡的灵敏指标。
PI（碘化丙啶）：PI是一种核酸染料，无法透过活细胞或早期凋亡细胞的完整细胞膜。然而，在凋亡中晚期和细胞坏死时，细胞膜的通透性增加，PI能够进入细胞内并与DNA结合，使细胞核呈现红色荧光。
将Annexin V与PI联合使用，可以区分出活细胞（Annexin V-/PI-）、早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）、晚期凋亡细胞和坏死细胞（Annexin V+/PI+）。
二、材料与仪器：
实验试剂：
Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒、PBS（磷酸盐缓冲液）、细胞培养液等
实验仪器：
流式细胞仪、离心机、CO2培养箱、生物安全柜、显微镜、移液器、离心管、细胞培养板、滤网
三、实验步骤：
1、收集细胞：
在进行完细胞凋亡刺激后，用预冷的PBS洗涤细胞2次。4℃离心5分钟，贴壁细胞需使用不含EDTA的胰酶消化。
2、重悬细胞：
取1～5×10^5个重悬的细胞，离心弃掉PBS。加入Annexin V-FITC结合液轻轻重悬。
3、染色：
加入Annexin V-FITC和PI Staining Solution，轻轻混匀。避光、室温孵育10～15分钟，随后置于冰上。
4、检测：
使用流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光（激发波长488nm，发射波长525nm），PI为红色荧光（激发波长535nm，发射波长615nm）。
也可在荧光显微镜下用双色滤光片观察，Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。
※实验结果示例：
细胞凋亡
四、注意事项
1、避光操作：Annexin V-FITC和PI都是光敏物质，因此整个染色和检测过程应在避光条件下进行。
2、准确控制时间：PI染色时间过长可能导致检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，上机前5分钟再加入PI染色。
3、细胞洗涤：在细胞洗涤的后一步，应尽量将上清弃净，以免PBS残留影响实验结果。
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文献和实验示例： Jurkat细胞用1μM喜树碱(Camptothecin) (左)或未加药 (右)处理4h，FITC-Annexin V/PI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒染色后，流式细胞仪荧光检测。 Annexin V-FITC单阳性细胞为早期凋亡细胞，Annexin V-FITC和PI染色双阳性的细胞为坏死细胞或者晚期凋亡。PI单染色阳性位裸核细胞。 实测数据可能会因细胞类型、细胞凋亡情况，检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。 流式检测细胞凋亡的数据分析方法： 1） 选中所有颗粒，将FSC
膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI 则被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。 图Annexin V 检测细胞凋亡原理二、试剂盒组份
Annexin V-PI 双染法 在细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在DNA片段化之前，因而检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是相对分子质量为35 000大小的Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(P1)来区分凋亡和坏死细胞。PI
