检测实验丨流式细胞术检测细胞凋亡 (Annexin V/PI

流式细胞术检测细胞凋亡

 (Annexin V/PI 法）

流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物学和医学领域的强大技术，能够快速、准确地分析细胞群体中的多种参数。

在细胞凋亡检测中，Annexin V/PI双染法是一种常用的方法，结合了Annexin V对早期凋亡细胞的敏感性和PI对晚期凋亡及坏死细胞的识别能力，从而能够区分不同阶段的凋亡细胞。

一、原理：

Annexin V：Annexin V是一种钙依赖的磷脂结合蛋白，对磷脂酰丝氨酸（PS）具有高度亲和力。在细胞凋亡早期，PS会从细胞膜内侧翻转到外侧，这使得Annexin V能够结合到凋亡细胞的表面，作为检测早期凋亡的灵敏指标。

PI（碘化丙啶）：PI是一种核酸染料，无法透过活细胞或早期凋亡细胞的完整细胞膜。然而，在凋亡中晚期和细胞坏死时，细胞膜的通透性增加，PI能够进入细胞内并与DNA结合，使细胞核呈现红色荧光。

将Annexin V与PI联合使用，可以区分出活细胞（Annexin V-/PI-）、早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）、晚期凋亡细胞和坏死细胞（Annexin V+/PI+）。

二、材料与仪器：

实验试剂：

Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒、PBS（磷酸盐缓冲液）、细胞培养液等

实验仪器：

流式细胞仪、离心机、CO2培养箱、生物安全柜、显微镜、移液器、离心管、细胞培养板、滤网

三、实验步骤：

1、收集细胞：

在进行完细胞凋亡刺激后，用预冷的PBS洗涤细胞2次。4℃离心5分钟，贴壁细胞需使用不含EDTA的胰酶消化。

2、重悬细胞：

取1～5×10^5个重悬的细胞，离心弃掉PBS。加入Annexin V-FITC结合液轻轻重悬。

3、染色：

加入Annexin V-FITC和PI Staining Solution，轻轻混匀。避光、室温孵育10～15分钟，随后置于冰上。

4、检测：

使用流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光（激发波长488nm，发射波长525nm），PI为红色荧光（激发波长535nm，发射波长615nm）。

也可在荧光显微镜下用双色滤光片观察，Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。

※实验结果示例：

细胞凋亡

四、注意事项

1、避光操作：Annexin V-FITC和PI都是光敏物质，因此整个染色和检测过程应在避光条件下进行。

2、准确控制时间：PI染色时间过长可能导致检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，上机前5分钟再加入PI染色。

3、细胞洗涤：在细胞洗涤的后一步，应尽量将上清弃净，以免PBS残留影响实验结果。