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细胞凋亡检测/流式细胞检测/细胞功能检测

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和元生物技术(上海)股份有限公司
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简介: 利用Annexin-V-FITC与PI双染法对和正常的细胞、human Oct-4干扰组以及对照组A549细胞的凋亡情况进行检测,研究Oct-4对A549细胞凋亡的影响。实验结果显示Oct-4基因的沉默使A549细胞的凋亡比例增加。为进一步深入研究Oct-4基因的功能提供实验数据。
提供商: oobio
服务名称: 细胞凋亡/细胞凋亡检测/流式细胞检测/\细胞功能检测/细胞实验

细胞凋亡/细胞凋亡检测/流式细胞检测/\细胞功能检测/细胞实验

 

摘要:

利用Annexin-V-FITC与PI双染法对和正常的细胞、human Oct-4干扰组以及对照组A549细胞的凋亡情况进行检测,研究Oct-4对A549细胞凋亡的影响。实验结果显示Oct-4基因的沉默使A549细胞的凋亡比例增加。为进一步深入研究Oct-4基因的功能提供实验数据。

关键词:Oct-4干扰,细胞凋亡, A549

 

一、实验原理

细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自主结束其生命的过程。它是一个主动的,高度有序的,基因控制的,一系列酶参与的过程。细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段:接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化(Caspase)→进入连续反应过程。

磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS 高亲和力特异性结合。将Annexin V 进行荧光素(FITC、PE)或Biotin 标记,以标记了的Annexin V 作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin V 与PI 匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

用Oct-4干扰慢病毒感染A549细胞组与正常细胞组、对照细胞组进行比较分析,使用Annexin-V-FITC/PI双染法考查Oct-4基因对细胞凋亡产生的影响。

 

三、 实验步骤

实验共分以下4个主要步骤:
1. 转染细胞
准备细胞,转染前一天按照60-70%密度铺在6孔板中。16h后,按照转染试剂说明书转染细胞(4μg对照/干扰质粒,10μL转染试剂lipofectamine 2000)
2. 收集细胞:
转染72h后,将细胞消化后制成单细胞悬液,计数,为满足流式细胞仪上机要求,每个样品准备0.5-1.0×106 cells
3. Annexin-V-FITC/PI双染进行染色;
a) 1000g离心5min
b) 使用预冷的PBS洗涤细胞沉淀1次,1000g离心5min,弃上清
c) 实验组加入195μL Annexin-V-FITC结合液重悬细胞(空细胞和空细胞PI单染校正用200μL结合液重悬沉淀) 。
d) 加5μL Annexin-V-FITC,用100μL枪轻轻混匀(空细胞和空细胞PI单染校正样品不加)
e) 室温孵育10min,1000g,5min,弃上清
f) 加入190μL Annexin-V-FITC结合液重悬沉淀(空细胞和空细胞PI单染校正组用200μL结合液重悬沉淀)
g) 加10μL PI,用100μL枪轻轻混匀(空细胞和空细胞单染Annexin-V-FITC校正组不加)。
4. 上机检测;
冰浴避光放置,将细胞移到流式上机管中,上机检测。

 

四、 实验结果

图1. Oct-4基因对A549细胞凋亡的影响

从左开始依次为A549空细胞组,对照组(干扰对照组),实验组(Oct-4干扰组),每组实验均重复3次

图2. Oct-4基因对A549细胞凋亡统计学分析

**表示p<0.01

结论:从图1实验结果以及图2的统计分析可以发现,A549细胞在Oct-4基因被干扰后,晚期凋亡比例高于空细胞组以及对照组,且具有统计学意义(p<0.01)。

 

五、参考文献
1. Sandström K, Håkansson L, Lukinius A, Venge P.A method to study apoptosis in eosinophils by flow cytometry.J Immunol Methods. 2000 Jun 23;240(1-2):55-68.
2. Chen S, Cheng AC, Wang MS, Peng X.Detection of apoptosis induced by new type gosling viral enteritis virus in vitro through fluorescein annexin V-FITC/PI double labeling.World J Gastroenterol. 2008 Apr 14;14(14):2174-8.
3. Lund PK, Øvstebø R, Møller AS, Olstad OK, Landsverk KS, Hellum M, Kierulf P.Using global gene expression patterns to characterize Annexin V positive and negative human monocytes in culture.Scand J Clin Lab Invest. 2009;69(2):251-64.
4. Arur S, Uche UE, Rezaul K, Fong M, Scranton V, Cowan AE, Mohler W, Han DK.Annexin I is an endogenous ligand that mediates apoptotic cell engulfment.Dev Cell. 2003 Apr;4(4):587-98.
5. Ashkenazi A, Dixit VM.Death receptors: signaling and modulation.Science. 1998 Aug 28;281(5381):1305-8.

 

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一、详细介绍         细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程,可分为间期和分裂期两个阶段。在这一过程中,细胞的遗传物质复制并均等分配给子代细胞。目前,常用PI(碘化丙啶)渗入检测细胞周期:PI是一种双链DNA荧光染料,可以和双链DNA结合产生荧光,且荧光强度和DNA的含量成正比,通过流式细胞仪对DNA含量的测定,可对细胞周期进行分析。通常,G0/G1期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间,通过PI荧光强度的检测可将G0/G1期、S期、G2/M期分开,并得出相应的百分比。         细胞凋亡(apoptosis)是细胞在生理或病理条件下,遵循特定程序发生的程序性死亡。凋亡可通过PI和Annexin V染色进行分析。1)PI染色:细胞发生凋亡时,由于胞浆和染色质浓缩及DNA片段化导致基因组DNA片段在染色过程中丢失,在PI染色时会呈现明显的弱染,在流式检测的荧光图上出现sub-G1峰(凋亡峰)。凋亡早期,细胞对前向角光散射能力显著降低,对侧向光散射的能力增加或无变化;凋亡后期,前向和侧向光散射信号均降低,通过观测细胞光散射的变化对细胞凋亡进行分析。2)Annexin V染色:Annexin V是一种钙依赖性磷脂结合蛋白,可与PS发生特异性结合,正常情况下磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞膜内侧,但发生凋亡时,PS会翻转到细胞膜的外侧。用FITC、PE或biotin标记的Annexin V作为荧光探针可检测细胞凋亡的发生。 二、服务项目及周期 服务编号 项目名称 周期(工作日) CS0001 CS0002 CS0010 CS0011 CS0012 细胞培养 药物处理或者病毒感染 MTT绘制细胞生长曲线 MTT检测细胞活力 MTT检测细胞凋亡
细胞凋亡/细胞凋亡检测/流式细胞检测/\细胞功能检测/细胞实验 摘要:利用Annexin-V-FITC与PI双染法对和正常的细胞、human Oct-4干扰组以及对照组A549细胞的凋亡情况进行检测,研究Oct-4对A549细胞凋亡的影响。实验结果显示Oct-4基因的沉默使A549细胞的凋亡比例增加。为进一步深入研究Oct-4基因的功能提供实验数据。关键词:Oct-4干扰,细胞凋亡, A549 一、实验原理细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自主结束其生命的过程。它是一个主动的,高度有序的,基因控制的,一系列酶参与的过程。细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段:接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化(Caspase)→进入连续反应过程。磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS 高亲和力特异性结合。将Annexin V 进行荧光素(FITC、PE)或Biotin 标记,以标记了的Annexin V 作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin V 与PI 匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。用Oct-4干扰慢病毒感染A549细胞组与正常细胞组、对照细胞组进行比较分析,使用Annexin-V-FITC/PI双染法考查Oct-4基因对细胞凋亡产生的影响。 三、 实验步骤实验共分以下4个主要步骤:1. 转染细胞准备细胞,转染前一天按照60-70%密度铺在6孔板中。16h后,按照转染试剂说明书转染细胞(4μg对照/干扰质粒,10μL转染试剂lipofectamine 2000)2. 收集细胞:转染72h后,将细胞消化后制成单细胞悬液,计数,为满足流式细胞仪上机要求,每个样品准备0.5-1.0×106 cells3. Annexin-V-FITC/PI双染进行染色;a) 
在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸     (PS) 由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度 亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的 灵敏指标之一。      将Annexin V进行荧光素(EGFP、FITC)标记,以标记了的Annexin V作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可 检测细胞凋亡的发生。  实验步骤:  1. 搜集细胞  2. 加入5μLAnnexin V-FITC,轻轻混  3. 室温避光孵育  4. 离心,加Annexin V-FITC重悬细胞  5. 加染色液,室温避光保存  6. 流式细胞仪检                    结果示意图:    服务周期:  服务内容 说明 价格∕元 实验周期 流式凋亡 建议3重复 200元/样 3个工作日    温馨提醒:    至少提供108个细胞 

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