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细胞凋亡检测/流式细胞检测/细胞功能检测

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细胞凋亡检测/流式细胞检测/细胞功能检测
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  • 利用Annexin-V-FITC与PI双染法对和正常的细胞、human Oct-4干扰组以及对照组A549细胞的凋亡情况进行检测,研究Oct-4对A549细胞凋亡的影响。实验结果显示Oct-4基因的沉默使A549细胞的凋亡比例增加。为进一步深入研究Oct-4基因的功能提供实验数据。
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    服务名称: 细胞凋亡/细胞凋亡检测/流式细胞检测/\细胞功能检测/细胞实验

    细胞凋亡/细胞凋亡检测/流式细胞检测/\细胞功能检测/细胞实验

     

    摘要:

    利用Annexin-V-FITC与PI双染法对和正常的细胞、human Oct-4干扰组以及对照组A549细胞的凋亡情况进行检测,研究Oct-4对A549细胞凋亡的影响。实验结果显示Oct-4基因的沉默使A549细胞的凋亡比例增加。为进一步深入研究Oct-4基因的功能提供实验数据。

    关键词:Oct-4干扰,细胞凋亡, A549

     

    一、实验原理

    细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自主结束其生命的过程。它是一个主动的,高度有序的,基因控制的,一系列酶参与的过程。细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段:接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化(Caspase)→进入连续反应过程。

    磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS 高亲和力特异性结合。将Annexin V 进行荧光素(FITC、PE)或Biotin 标记,以标记了的Annexin V 作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

    碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin V 与PI 匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

    用Oct-4干扰慢病毒感染A549细胞组与正常细胞组、对照细胞组进行比较分析,使用Annexin-V-FITC/PI双染法考查Oct-4基因对细胞凋亡产生的影响。

     

    三、 实验步骤

    实验共分以下4个主要步骤:
    1. 转染细胞
    准备细胞,转染前一天按照60-70%密度铺在6孔板中。16h后,按照转染试剂说明书转染细胞(4μg对照/干扰质粒,10μL转染试剂lipofectamine 2000)
    2. 收集细胞:
    转染72h后,将细胞消化后制成单细胞悬液,计数,为满足流式细胞仪上机要求,每个样品准备0.5-1.0×106 cells
    3. Annexin-V-FITC/PI双染进行染色;
    a) 1000g离心5min
    b) 使用预冷的PBS洗涤细胞沉淀1次,1000g离心5min,弃上清
    c) 实验组加入195μL Annexin-V-FITC结合液重悬细胞(空细胞和空细胞PI单染校正用200μL结合液重悬沉淀) 。
    d) 加5μL Annexin-V-FITC,用100μL枪轻轻混匀(空细胞和空细胞PI单染校正样品不加)
    e) 室温孵育10min,1000g,5min,弃上清
    f) 加入190μL Annexin-V-FITC结合液重悬沉淀(空细胞和空细胞PI单染校正组用200μL结合液重悬沉淀)
    g) 加10μL PI,用100μL枪轻轻混匀(空细胞和空细胞单染Annexin-V-FITC校正组不加)。
    4. 上机检测;
    冰浴避光放置,将细胞移到流式上机管中,上机检测。

     

    四、 实验结果

    图1. Oct-4基因对A549细胞凋亡的影响

    从左开始依次为A549空细胞组,对照组(干扰对照组),实验组(Oct-4干扰组),每组实验均重复3次

    图2. Oct-4基因对A549细胞凋亡统计学分析

    **表示p<0.01

    结论:从图1实验结果以及图2的统计分析可以发现,A549细胞在Oct-4基因被干扰后,晚期凋亡比例高于空细胞组以及对照组,且具有统计学意义(p<0.01)。

     

    五、参考文献
    1. Sandström K, Håkansson L, Lukinius A, Venge P.A method to study apoptosis in eosinophils by flow cytometry.J Immunol Methods. 2000 Jun 23;240(1-2):55-68.
    2. Chen S, Cheng AC, Wang MS, Peng X.Detection of apoptosis induced by new type gosling viral enteritis virus in vitro through fluorescein annexin V-FITC/PI double labeling.World J Gastroenterol. 2008 Apr 14;14(14):2174-8.
    3. Lund PK, Øvstebø R, Møller AS, Olstad OK, Landsverk KS, Hellum M, Kierulf P.Using global gene expression patterns to characterize Annexin V positive and negative human monocytes in culture.Scand J Clin Lab Invest. 2009;69(2):251-64.
    4. Arur S, Uche UE, Rezaul K, Fong M, Scranton V, Cowan AE, Mohler W, Han DK.Annexin I is an endogenous ligand that mediates apoptotic cell engulfment.Dev Cell. 2003 Apr;4(4):587-98.
    5. Ashkenazi A, Dixit VM.Death receptors: signaling and modulation.Science. 1998 Aug 28;281(5381):1305-8.

     

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