20min全能基因组DNA提取试剂盒

描述：
该试剂盒采用独特的裂解液，可快速可靠的从动物组织、细胞、细菌、病毒、全血、血清、血浆、体液、病毒液、棉拭孖等样品中纯化出高纯度的 DNA。可直接用于限制性酶切反应、PCR、文库构建、Southern 杂交等多种分子生物学实验。

操作方法：
（一）RNA 含量较高的动物组织、细胞、细菌样本的提取方法
（1） 样品组织悬液的制备：动物组织用研钵研磨：将动物组织研磨粉碎，并取 40~60 mg 加入到 1.5ml EP 管中，加入 280 μl 无菌水，漩涡震荡 10s混合均匀，打开管盖加入 50 μl 的 Buffer AP4 裂解液和 5 μl 的 RnaseA，漩涡震荡 10s 混合均匀，室温消化 5min，以去除RNA。动物组织用钢珠研磨：取 50~80 mg 组织加入到 400 μl 无菌水，在研磨仪上研磨 1min。在 1.5 ml EP 管底部加入 50 μl 的Buffer AP4 裂解液，并在管盖上加入 5 μl 的 RnaseA，取 280 μl 研磨好的组织悬液到 1.5 ml EP 管中，漩涡 10s 混合均匀，室温消化 5min，以去除 RNA。悬浮的细胞（104~108 个）或细菌（106~1011 个）：在 1.5 ml EP 管底部加入 50 μl 的 Buffer AP4 裂解液，并在管盖上加入5 μl 的 Rnase A，直接吸取 280 μl 样品到上述 EP 管中，漩涡震荡 10s 混合均匀，室温消化 5min，以去除 RNA。细胞或细菌沉淀：可用 280 μl 无菌水重悬细胞和细菌沉淀，并加入 50 μl 的 Buffer AP4 裂解液和 5 μl 的 RnaseA，漩涡震荡 10s 混合均匀，室温消化 5min，以去除 RNA。
（2）RNA 消化完毕后，向上述溶液中加入 20 μl 的蛋白酶 K，漩涡 10s 混合均匀，并置于 56℃水浴锅(或室温条件下)中消化 5min。
（3）消化完毕后，向上述溶液中加入 500 μl 的 Buffer LB5，漩涡混合 15s 后，13000rpm 最高转速离心 2min。将上清液倒入到吸附柱中。
（4）13000rpm 离心 1min，弃过柱液。向吸附柱中加入 500 μl 的 Washing Buffer，13000rpm 离心 15s。弃过柱液，并重复此步骤一次。
（5）将吸附柱重新放回离心机，13000rpm 空离心 2min，将残留的乙醇彻底甩干。
（6）将吸附柱芯放入到 1.5 ml 收集管中，向吸附柱芯中加入 60~150 μl DNA Elution Buffer，室温放置 1min，13,000rpm离心 2min，洗脱液即为基因组 DNA，冷冻保存。
（二）RNA 含量较低的样本（全血、血清、血浆、体液、病毒液、棉拭孖浸泡液等）的提取方法在 1.5 ml EP 管底部预先加入 50 μl 的 Buffer AP4 裂解液，在管盖上加入 20 μl 的蛋白酶 K，直接吸取 280 μl 的液体样本到 Buffer AP4 裂解液中。上下颠倒，并漩涡混合 10s，使得样品、Buffer AP4 裂解液、蛋白酶 K 混合均匀，并置于 56℃水浴锅中（或室温）消化 5min。按照上述步骤（3）-（6）进行上柱、漂洗、洗脱操作。

货号	产品名称	规格
XG-P3115	20min全能基因组DNA提取试剂盒	50T

 

 PCR反应条件优化：
1、变性温度和时间：
20min全能基因组DNA提取试剂盒保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
2、复性温度和时间:
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。
3、延伸温度和时间:
一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。
4、循环数:
其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。
 

PCR的特点：
特异性强：使用两对引物进行扩增提高了特异性，第一轮PCR中由外引物错配产生非特异性产物，同时在第二轮PCR中内引物与错误片段配对扩增的概率极低，降低了扩增多个靶位点的可能性。
灵敏度高：进行两轮PCR扩增，可以执行更多的循环，从低拷贝样本中扩增得到足量的产物，克服了单次扩增平台期限制，提高PCR的灵敏度。

 
降落PCR与温度梯度PCR的区别：
降落PCR与温度梯度PCR都是对反应体系中的退火温度进行优化，但两者在原理上有所不同。
温度梯度PCR是为了找到最适的退火温度，设置不同的退火温度进行多管PCR，将其分别放置在PCR仪中的不同温度模块进行反应，最终找到最适的退火温度，并进一步以此退火温度进行普通PCR扩增。
降落PCR是为了提高反应的特异性，通过设计一系列不断降低的退火温度，在同一PCR管内进行PCR扩增，最终获得大量的特异性扩增产物。
与温度梯度PCR相比，降落PCR更有优势。温度梯度PCR需要多次反应或多管反应找到最适的退火温度，之后还需以找到的最适退火温度再次进行PCR，才能得到较好的扩增效果，操作比较繁琐。降落PCR只需一次反应就可以获得很好的扩增效果，避免了对每对引物进行最适退火温度的优化和测定工作。
降落PCR适用于不确定引物的最适Tm值，或引物扩增效果不佳时，不了解目的模板同源性程度，使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。根据不同实验的需要，降落PCR还可与其它PCR方法同时使用，如实时定量降落PCR、竞争降落PCR等。
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