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细胞污染是细胞培养中最常见且影响严重的挑战，可能导致实验失败、数据不可靠甚至资源浪费。污染类型包括生物性（细菌、真菌、支原体等）、化学性、物理性及气溶胶污染。由于多数污染一旦发生难以彻底清除，因此预防远胜于补救。

区分Vero细胞污染与细胞凋亡需要仔细观察细胞培养的外观和使用特定的检测方法。

在ELISA实验中，加样后的混匀是关键步骤之一。若样本与试剂未充分混合，可能导致局部浓度不均、非特异性吸附增强或反应效率下降，进而影响OD值的准确性和重复性。尤其在标准品稀释、血清样本加入酶标板等环节，混匀操作尤为重要。

PCR产物纯化过程中，DNA需先吸附于硅胶膜或树脂上，再经洗涤去除非特异性杂质，最后洗脱获得纯净DNA。任何一步操作不当都可能导致DNA损失。

聚合酶链式反应（PCR）是分子生物学的核心技术，用于扩增特定DNA片段。然而，实验过程复杂，涉及多个关键组分（如引物、酶、模板、dNTPs、Mg²⁺）和精确的温度循环。任何一个环节出错都可能导致无扩增、非特异性条带或假阳性结果。了解常见错误及其根源，对快速排查故障至关重要。 常见问题与解决策略 PCR实验中最常见的问题可以归纳为以下几类： 1.无扩增条带或产物量过少 这是最基础也最常见的问题，可能由多种因素导致。 模板问题：模板量太少、降解或含有抑制剂（如甲醛固定组织中的甲酸）。 试剂失效：Taq DNA聚合酶失活（运输或保存不当）、引物变质或未加入关键试剂（如忘加酶）。 反应条件不当：退火温度过高（引物无法结合）或过低（非特异结合），循环数不足，延伸时间太短（尤其对于长片段）。 成分浓度失衡：Mg²⁺浓度过低、dNTP浓度不足或引物量不够。 2.出现非特异性条带（杂带或多条带） 扩增出了目标之外的DNA片段。 引物问题：引物特异性差（与非目的序列有同源性）、引物浓度过高、引物二聚体形成。 反应条件：退火温度过低、Mg²⁺浓度过高、循环次数过多。 酶与体系：使用了非热启动酶，导致低温下发生非特异性扩增；反应缓冲液未混匀。 3.污染导致假阳性 阴性对照出现条带，是最令人头疼的问题之一。 来源：气溶胶污染（扩增产物、质粒DNA）、试剂/枪头/工作台污染、交叉污染（移液操作不慎）。 解决核心：严格的物理隔离（分区操作）、化学消毒（10%漂白剂、紫外线照射）、使用一次性耗材。 4.条带大小不符或异常电泳图 结果与预期不符。 原因：模板或引物使用错误、存在基因亚型、PCR产物降解（电泳检测超过48小时后）。 电泳问题：凝胶未完全凝固、缓冲液浓度不一致、琼脂糖质量差。 5.定量PCR（qPCR）特有异常 针对荧光定量实验。 无Ct值：循环数不够、程序设置错误（未采集荧光）、引物/探针降解、模板量过低或含抑制剂。 标准曲线不佳：标准品稀释不准、已降解、模板中存在抑制物。 熔解曲线多峰：提示扩增产物不单一，可能存在引物二聚体或非特异性扩增，需优化引物和退火温度。 为了更清晰地对比，以下是常见问题、可能原因及解决方案的总结表： 问题现象 可能原因 解决方案 无扩增条带 模板量少/降解/含抑制剂；酶失活；引物失效；退火温度过高；循环数不足 增加模板量并纯化；更换新酶或引物；梯度优化退火温度；增加循环数（一般不超过45） 产物量过少 退火温度不合适；模板量少；循环数不足；引物量不足；延伸时间短 进行梯度PCR优化退火温度；增加模板和引物量；增加循环数；按1kb/min设置延伸时间 非特异性条带 (杂带) 引物特异性差/浓度过高；退火温度过低；Mg²⁺浓度过高；循环次数过多 重新设计引物；降低引物浓度；提高退火温度；降低Mg²⁺浓度；减少循环次数 阴性对照有条带 (污染) 试剂、枪头、工作台被扩增产物或模板污染 使用全新试剂和耗材；清洁工作台（10%漂白剂）；紫外线照射；严格分区操作 条带大小不符 模板或引物错误；基因亚型；污染 核对模板和引物序列；进行BLAST分析；确保操作无污染 qPCR无Ct值 循环数不够；程序设置错误（未采荧光）；引物/探针降解；模板含抑制剂 检查程序设置；更换引物/探针；稀释模板以降低抑制物影响 熔解曲线多峰 扩增产物不单一（引物二聚体或非特异扩增） 优化引物设计，避免二聚体；提高退火温度；使用SYBR Green时必做熔解曲线 ✅ 结论 成功进行PCR实验的关键在于严谨的设计和细致的操作。遇到问题时，应系统性地从 引物设计、模板质量、试剂状态、反应条件（尤其是退火温度和Mg²⁺浓度）以及防污染措施这几个方面逐一排查。建立标准化操作流程（SOP）和实验室分区制度，能有效预防大部分污染问题。