免疫印迹wb实验

免疫印迹（Western blot, WB）是蛋白组学中检测复杂生物提取物中特定蛋白质存在的最常用方法之一。WB先要进行 SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原 - 抗体 - 标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。

01

蛋白提取

➊ 细胞样品在提取前需要使用PBS清洗两遍，以减少培养基对样品的干扰，悬浮细胞可500Xg低速离心后收集进行蛋白提取。贴壁细胞可在培养器皿中直接进行蛋白提取。蛋白提取前建议进行细胞计数，以确定提取中添加裂解液的比例，得到最佳提取效率。

 

❷ 组织样品在提取前也需要用PBS清洗，一些含血量丰富的组织，建议使用红细胞裂解液去除红细胞，以避免血液中IgG对后续实验的影响。

 

❸ 为了防止蛋白降解、去磷酸化，各种蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂都是必须的。

 

❹ 在提取蛋白的时候仅仅靠裂解液有时候也不能达到完全抽提的效果，有条件的话，可以对抽提悬液进行超声破碎处理；超声的时候，因为超声发热损伤蛋白，需要把要超声的样本放到冰水混合物里。

 

❺ 此外如果没有裂解buffer，可以用1×SDSloading buffer代替来抽提蛋白，其效果类似于SDS裂解液，不过抽提后的样本不能进行浓度测定。

 

❻ 蛋白煮沸变性一般是95-100°C，5-10min，水浴锅煮沸时，可用带夹EP管防止EP管盖弹开，使水浴锅内的水进入而使样品废掉。

02

蛋白电泳

正确选择凝胶浓度与电泳条件能够让目的蛋白区域最大限度的分离开，从而使条带的位置，杂带位置等一些因素的影响降到最低；目的蛋白分子量与胶浓度的选择见下表：

蛋白质分子量范围(KD)	凝胶浓度(%)
<10	15
10-30	12
30-100	10
100-500	8
>500	6

采用SDS-PAGE电泳，每孔上样等体积总蛋白，上样时，先加marker，如有空置的加样孔，须加等体积的1×loading buffer，以防相邻泳道样品的扩散。开始电压为80V，使样品跑得慢一些，充分浓缩，到达分离胶后调为120V，电泳至溴酚蓝要跑出即可终止电泳。关于电泳液，建议新鲜配制，也可先配10x的，然后现用现稀释。

Tips：蛋白电泳

 

➊ 玻璃板清洗后，为了使表面的水快速晾干，可以在烘箱中放置几分钟，拿出来的时候后需平衡至室温再灌胶，不然很容易产生气泡；

 

❷ 配胶用的试剂一般都是在4度冰箱保存，当我们按比例配好混合液的时候，要等混合液恢复室温时，再灌胶，不然也很容易产生气泡；

 

❸ 玻加水液封时，速度要慢，可用1ml枪沿着胶板上沿反复移动，不然很容易将分离胶冲变形；

 

❹ 梳子注意和玻璃板匹配，1.5mm的梳子很难插进1mm的玻璃板中；如果1mm的梳子插到了1.5mm的玻璃板中，由于中间有空隙，就会有胶凝固在里面；

 

❺ 浓缩胶凝好可以泡到电泳缓冲液里，比较容易拔出。

03

蛋白转膜

膜的选择

 

➊ 现在用的最多的是PVDF膜，用之前需注意：①先在纯甲醇中浸湿膜15s，保证PVDF膜充分活化；②将膜放入转膜缓冲液中平衡至少5min；

 

❷ NC膜不需要甲醇活化。

 

膜的孔径

 

➊ 根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的印迹膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固；

 

❷ 通常用0.45μm和0.2μm两种规格的印迹膜。大于20KD的蛋白可用0.45μm 的膜，小于20KD的蛋白就要用0.2μm的膜。

 

小分子蛋白

 

➊ 小分子蛋白很容易转过，所以摸索适合自己蛋白的转膜条件很重要，这一步很难说一次就成功，所以刚开始的时候可以在接触胶面的PVDF膜上再放一张PVDF膜，转膜结束后，立春红染色，观察使用的条件是否会转过头；

 

❷ 小分子蛋白转膜液中一定不要加SDS，因为SDS会影响转膜效果；

 

❸ 小分子蛋白湿转参考100V恒压，或者150-200恒流，40-60min，都可以跑出来结果，同时也可以保证内参的效果很好；

 

❹ 小分子蛋白转膜液甲醇浓度为20%；

 

❺ 分子量小于10 kDa的多肽或蛋白，建议使用Tricine-SDS-PAGE电泳和转膜系统。

 

大分子蛋白

 

➊ 转膜时间要适当延长，220V，300mA，湿转，建议时间在2h30min-3h，因为转膜时间很长，可以预冷转膜缓冲液，同时提前准备好足够的冰袋降温；

 

❷ 转膜液中可以加入适量SDS（浓度0.1%），对于大分子量蛋白加入SDS是为了增加了蛋白表面电荷，从而增加转膜效率；

 

❸ 大分子蛋白转膜液甲醇浓度为5%。