免疫组化（IHC）

免疫组化是利用抗体和抗原之间高度特异性结合的原理，先用抗体将组织或细胞中的目的蛋白作为抗原特异性结合，再借助化学的方法将抗体结合的部位显示出来，以达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。
2⃣️抗原修复
将组织切片置于装满柠檬酸抗原修复缓冲液的修复盒中，置于微波炉中进行抗原修复，中火8 min至沸，静置8 min后保温，再转中低火7 min。自然冷却后将玻片置于PBS缓冲液中，在摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。

3⃣️阻断内源性过氧化物酶
将切片置于3%双氧/水溶液中，室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS中，在摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。

4⃣️血清封闭
用组化笔在切片周围画一个组化圈，在组化圈内滴加3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭30 min。

5⃣️加一抗
轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定稀释比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4 °C孵育过夜。

6⃣️加二抗
将玻片置于PBS中，在摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在组化圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，室温孵育50 min。

7⃣️DAB显色
将玻片置于PBS中，在摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在组化圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，当出现棕黄色时即使用自来水冲洗切片，以终止显色。

8⃣️复染细胞核
苏木素复染3 min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。
9⃣️脱水封片
将切片依次按照75%乙醇5 min→85%乙醇5 min →无水乙醇Ⅰ 5 min →无水乙醇Ⅱ 5 min→正丁醇5 min→二甲苯Ⅰ 5 min 进行脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，即可用中性树胶封片。
染色观察
使用全自动玻片扫描仪对玻片进行扫描，将图片导出后使用Image J软件统计阳性区域，免疫组化图片使用光学显微镜进行观察拍照。