- ￥6980
- 采用CRISPR/Cas9基因敲除系统， 脱靶率低。提高转染率，实验周期短，价格实惠，不成功不收费
- 广州
- 2025年10月16日
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- 详细信息
- 询价记录
- 文献和实验
- 技术资料
- 提供商：
艾迪基因
- 服务名称：
基因编辑服务
- 规格：
株
▍ 基因敲除细胞
CRISPR是一种来源于细菌免疫系统的基因编辑技术，能精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸序列，利用核酸内切酶蛋白对DNA靶点序列进行切割，产生双链DNA断裂，断裂将在体内被细胞修复机制修复，其中，非同源末端连接NHEJ这种修复将产生短的核酸插入或删除，其带来的基因移码突变，将导致提前出现终止密码子，从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的敲除。在PAM片段上游设计sgRNA后，通过构建基因敲除载体，结合慢病毒系统，可以实现外源基因的整合，利用抗生素或荧光，最终筛选出成功实现基因敲除的细胞。
基因敲除细胞是应用基因敲除技术，可精准地去除或失活特定基因。构建基因敲除的细胞模型，可揭示基因在生物体中的功能，并在药物靶点筛选、药物开发等领域有广泛的应用。现有的基因编辑工具有CRISPR/Cas9、TALENs或ZFNs等。目前，CRISPR/Cas9系统因其高效性和操作便捷性，已成为基因敲除的首要选择工具。该系统通过gRNA引导Cas9核酸酶，对目标DNA进行特异性的识别和切割，产生DNA双链断裂（DSB）。随后，细胞通过非同源末端连接（NHEJ）途径修复这些双链断裂。在修复过程中，常常会产生非三倍数的插入或缺失（indel），导致移码突变，进而实现基因敲除。
艾迪基因基于自主研发的CRISPR-EDITx基因编辑平台，采用优化升级的CRISPR/Cas9系统，可根据基因与细胞、实验目的，制定合适的敲除策略和方案，可高效地构建符合需求的基因敲除细胞模型。
▍ 服务详情
| 细胞类型 | 各种细胞类型，包括肿瘤、常规、干细胞、原代和永生化细胞系 |
|---|---|
| 服务类型 | 单基因敲除/多基因敲除/移码突变/片段敲除 |
| 交付标准 | 基因敲除单克隆细胞≥1株（2管细胞/株，1×106/管）；项目结题报告 |
| 周期 | 现货1周 （查看现货）；定制快至4周 |
| 价格 | 4980元起 ；具体可来电咨询18102225074 |
▍ 服务优势
▍ 服务类型
可根据客户需求、并综合基因和细胞等情况，设计基因敲除方案。
| 单基因敲除 | 实现单个基因的有效敲除 |
|---|---|
| 多基因敲除 | 实现多个基因的有效敲除 |
| 移码突变 | 针对编码基因的编码区前端设计sgRNA，实现碱基非3的倍数的indel |
| 片段敲除 | 针对基因设计sgRNA，实现基因片段的删除 |
▍ 服务流程
1.慢病毒法
2.质粒法
▍ 服务保证
（1）项目启动后，密切跟进实验进展，每两周进行一次项目进度汇报。
（2）项目结题报告包含sgRNA序列、实验详细记录、测序结果及分析等，满足客户后期论证材料需求。
（3）基因敲除阳性单克隆均经过靶标片段T载体克隆测序验证，保证基因敲除。
（2）项目结题报告包含sgRNA序列、实验详细记录、测序结果及分析等，满足客户后期论证材料需求。
（3）基因敲除阳性单克隆均经过靶标片段T载体克隆测序验证，保证基因敲除。
▍ KO细胞系产品
▍ 成功案例
根据客户需求，综合靶基因和细胞的情况，针对性地设计了基因敲除方案。
| 细胞 | 基因名 (ID) | Cell pool敲除率 |
| MH-S | Sirt2 (64383) | ★★★★★ |
| HEPG2 | MAP1S (55201) | ★★★★★ |
| BHK-21 | TMEM41b (101842799) | ★★★★★ |
| KGN | TFE3 (7030) | ★★★★★ |
| LLC | CILP (214425) | ★★★★★ |
| MDA-MB-231 | OLFML2A (169611) | ★★★★★ |
| ID8 | DUSP1 (19252) | ★★★★★ |
| HmrSv5 | FN1 (2335) | ★★★★★ |
| huh7 | EGFL9 (65989) | ★★★★★ |
| MKN28 | TRIM54 (57159) | ★★★★★ |
| MB49 | STUB1 (56424) | ★★★★★ |
| hela | TRAPPC2（6399） | ★★★★★ |
| L929 | RIPK1（19766） | ★★★★★ |
| Bv2 | PKM（18746） | ★★★★★ |
| caco-2 | PEPT1（6564） | ★★★★★ |
| MOC2 | Itga5（16402） | ★★★★★ |
| PC3 | HJURP（55355） | ★★★★★ |
| CFSC-8B | Rock2 (25537) | ★★★★★ |
| HT22 | DJ-1 | ★★★★★ |
| A549 | PKM1（5315） | ★★★★★ |
| kupffer | sirt6（50721） | ★★★★★ |
| HBMEC | S100A6(6277) | ★★★★★ |
| Mia PaCa-2 | MMP1（4312） | ★★★★★ |
| HLE B3 | PXDN | ★★★★★ |
| HepG2/Dox | PIK3CA（5290） | ★★★★★ |
| HEK293 | DDR1（780） | ★★★★★ |
| RPE1 hTERT p53-/- Cell | BMF（90427） | ★★★★★ |
| HEK293T | WTAP（9589） | ★★★★★ |
敲除效率（%）：★★★★★≥70%；★★★★≥50%；★★★≥30%；★★≥10%
● 移码突变
通过在靶位点引入小的插入/缺失（indels）以破坏开放阅读框，诱导提前终止密码子的生成，导致功能蛋白表达丧失。
通过单点编辑构建完全功能缺失模型的理想选择
案例Highlights
1、研究目的：HEK293细胞的单基因敲除
2、项目目标：成功高效敲除HEK293细胞系中的A基因，为后续功能研究提供稳健的模型
3、项目设计： sgRNA 设计于A基因的第2号外显子
4、测序结果： 在A基因sgRNA处发生了1个碱基缺失（敲除率100%），引起移码突变，提前终止表达，A基因敲除成功
● 片段敲除
精确删除较大片段的基因组区域（通常为数百至数千个碱基对），以移除基因中的关键外显子或功能结构域。
适用于去除关键功能区域，从而实现基因失活，并用于研究结构域特异性的功能影响
案例Highlights
1、研究目的：在Huh6细胞中实现精确的小片段敲除
2、项目目标：成功在Huh6细胞中敲除A基因的小片段，导致目标基因功能的丧失
3、项目设计： 在huh6 细胞中，针对A基因的编码区设计两条sgRNA，实现片段敲除
4、测序结果： 单克隆细胞株的测序验证结果显示，在A基因的sgRNA靶向位点处发生了73个碱基对的缺失（非3倍数缺失），可引起移码突变，敲除成功
● 3.双基因敲除
在同一细胞系或生物体内同时敲除两个基因。该方法用于研究基因间的相互作用、功能冗余或代偿机制。
通过同时靶向多个基因，有助于解析复杂的生物学网络
案例Highlights
1、研究目的：在THP-1细胞中实现双基因敲除
2、项目目标：成功在THP-1细胞中同时敲除B基因和C基因，从而开展基因相互作用及代偿机制的研究。
3、项目设计：在B基因外显子区域设计2个sgRNA，C基因外显子区域设计2个sgRNA。
1、研究目的：在THP-1细胞中实现双基因敲除
2、项目目标：成功在THP-1细胞中同时敲除B基因和C基因，从而开展基因相互作用及代偿机制的研究。
3、项目设计：在B基因外显子区域设计2个sgRNA，C基因外显子区域设计2个sgRNA。
B:
C:
4、测序结果：在THP-1细胞中，B基因sgRNA处发生了7个碱基缺失（敲除率100%），引起移码突变，提前终止表达，B基因敲除成功；同时C基因sgRNA处发生了2个碱基缺失（敲除率100%），引起移码突变，提前终止表达，C基因敲除成功。
B:
C:
▍ 案例分析
一、抗生素敏感浓度摸索
将细胞如下图1稀释。给药7天后，弃培养液，用台盼蓝染色2 min，显微镜下观察细胞存活情况。确定细胞多克隆细胞筛选和单克隆细胞筛选浓度。
图1 抗性浓度摸索
二、单克隆形成验证
细胞计数，将细胞悬液稀释混匀后加入96孔板，用封口胶将孔板封好，放于培养箱中培养。静置培养48 h后每日观察并记录单克隆形成情况。
三、靶标基因sgRNA 设计
根据基因序列信息，设计 sgRNA。
四、位点序列信息确认
PCR扩增（图2），测序验证基因序列，以确定sgRNA区域有无SNP。
图2 靶标序列扩增
五、敲除载体构建
退火，连接，转化，涂板（LB/Amp）培养。
每个实验组各挑取6个单克隆菌落，于LB/ Amp培养基中扩增，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测质粒提取效果（图3）。
图3 质粒抽提
酶切验证 ：取3个单克隆酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果（图4）。选择2个样品送样测序。
图4 单克隆酶切验证
六、慢病毒包装
敲除载体无内毒素质粒提取，病毒包装。
七、细胞转染
配制梯度病毒稀释液，细胞于培养箱中静置培养48h。
八、阳性多克隆细胞株筛选
九、阳性单克隆细胞株筛选
细胞转染48h后，更换完全培养基，筛选至对照组大部分细胞死亡，实验组细胞扩大培养，进行单克隆筛选。几天后挑选阳性单克隆进行扩增，并取样验证。
十、阳性单克隆细胞株验证
1、测序验证
提取阳性单克隆细胞株的基因组，将靶标基因酶切克隆至T载体后测序，以确定是否敲除成功。
结果示例：该基因有两个单克隆细胞株，A1和A2。
（1）单克隆细胞A1的目的基因在sgRNA2位置出现两种突变形式，分别缺失1个和19个碱基，在新序列的第337位和第355位碱基提前出现终止密码子。
（2）单克隆细胞A2的目的基因在sgRNA2位置发生突变，插入1个碱基，在新序列的第340位碱基提前出现终止密码子。
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文献和实验该产品被引用文献
▍ 参考文献
1.皮肤鳞状细胞癌细胞（SCC）中敲除BRD4基因
Bromodomain protein BRD4 promotes cell proliferation in skin squamous cell carcinoma
近年来，皮肤鳞状细胞癌的发病率以惊人的速度上升，皮肤鳞状细胞癌和其它非黑色素瘤皮肤癌每年都会导致大量的人类死亡。统计研究表明，超过20%的世界人口在一生中可能会发展成皮肤癌，目前的治疗选择包括手术、放疗和/或化疗的组合，但对于晚期和/或转移性皮肤鳞状细胞癌的预后仍然不令人满意。最近的癌症研究提出BRD4可能是一个潜在的致癌蛋白，但其在皮肤鳞状细胞癌中的表达和生物学功能尚未被研究。
研究人员开展了分子靶向治疗的研究，使用CRISPR/Cas9系统直接敲除BRD4基因。BRD4基因的敲除或沉默显著降低了皮肤鳞状细胞癌细胞（SCC）的增殖能力，导致SCC细胞中几个与细胞增殖密切相关的癌基因（如cyclin D1、Bcl-2和MYC）的表达显著下降。在体内实验中，通过CRISPR/Cas9介导的BRD4基因敲除显著抑制了A431细胞在严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠中的肿瘤生长。BRD4基因敲除细胞为进一步的临床研究和药物开发提供了科学依据，有助于开发针对BRD4的分子靶向治疗药物。
2.MDA-MB-231乳腺癌细胞中敲除成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）
GPER Mediates a Feedforward FGF2/FGFR1 Paracrine Activation Coupling CAFs to Cancer Cells toward Breast Tumor Progression
成纤维细胞生长因子（Fibroblast Growth Factor, FGF）—成纤维细胞生长因子受体（Fibroblast Growth Factor Receptor, FGFR）信号轴是介导肿瘤基质与癌细胞之间相互作用的主要信号传导途径之一，FGFR1的激活可以通过转位、点突变或FGFR1基因的扩增导致癌症恶化。此外，G蛋白偶联雌激素受体（GPER, GPR30）也被确认为介导雌激素在多种病理生理条件下作用的受体。
为探索GPER如何通过FGF2/FGFR1信号轴介导CAFs与乳腺癌细胞之间的通讯，研究人员使用了CRISPR/Cas9基因编辑技术来敲除MDA-MB-231乳腺癌细胞中的成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1），正常对照组中来自雌激素刺激的癌症相关成纤维细胞（CAFs）的条件培养基（CM）能够诱导FGFR1野生型（WT）MDA-MB-231细胞中CTGF（结缔组织生长因子）的表达，并通过FGFR1-ERK1/2-AKT信号通路促进细胞的迁移和侵袭。而在FGFR1基因敲除的MDA-MB-231细胞中，这种诱导作用则显著降低或消失。FGFR1基因敲除细胞揭示了GPER在肿瘤微环境中调节FGF2表达的新角色，证实了FGFR1在乳腺癌中的基因扩增与患者的整体存活率密切相关，表明FGFR1可能作为乳腺癌治疗的一个靶点，阐明了CAFs与乳腺癌细胞之间的旁分泌激活作用，为开发新的治疗策略提供了理论基础。
3.Swan71细胞系中敲除BRCA1基因
BRCA1 regulates HMGA2 levels in the Swan71 trophoblast cell line
在早期胎盘发育中，肿瘤抑制基因和癌基因共同工作，以一种受控的方式调节细胞增殖和分化。BRCA1是一个已知的肿瘤抑制基因，它与ZNF350和CtIP形成复合体，结合到HMGA2基因的启动子区域，阻止其转录。这种调控在癌症细胞中已有研究，但在胎盘细胞中的研究较少。
研究人员使用CRISPR-Cas9系统在Swan71细胞系中敲除BRCA1基因，生成了BRCA1基因敲除（BRCA1 KO）细胞，通过感染Swan71细胞与含有miR-182过表达构建的慢病毒颗粒，使miR-182在细胞中过表达。结果显示，与野生型细胞相比，BRCA1 KO细胞显示出显著增加的HMGA2 mRNA和蛋白水平；miR-182的过表达导致BRCA1蛋白水平下降，HMGA2蛋白水平上升。BRCA1基因敲除细胞表明BRCA1在调节滋养层细胞中的HMGA2水平方面发挥重要作用，并且可能通过影响细胞凋亡参与胎盘的发育和功能，为理解BRCA1在胎盘发育中的作用提供了新的视角。
4.NGP和CHP-134 NB细胞系中敲除ATM基因
ATM depletion induces proteasomal degradation of FANCD2 and sensitizes neuroblastoma cells to PARP inhibitors
神经母细胞瘤（Neuroblastoma, NB）是一种常见的儿童实体瘤，临床表现和预后具有高度的异质性，尽管采用了多种治疗策略，但高风险NB患者的肿瘤对标准治疗存在抵抗性，并可能发展成转移。ATM基因与DNA损伤反应有关，位于11q的ATM基因的杂合性缺失和ATM基因的半合性突变在NB肿瘤中是互斥的。在NB细胞系中，ATM的敲低已被证明可以在体外和体内促进肿瘤形成，但ATM与肿瘤形成和癌症侵袭性之间的关联尚不清楚。
研究人员使用CRISPR/Cas9技术敲除了NGP和CHP-134 NB细胞系中的ATM基因，分析ATM基因敲除细胞的增殖和集落形成能力，Western blot检测与DNA修复途径相关的不同蛋白的表达，并在ATM基因敲除细胞中稳定转染FANCD2表达质粒以过表达FANCD2，免疫荧光显微确定蛋白表达情况。结果显示，ATM的缺失导致FANCD2蛋白水平下降，完全ATM基因敲除细胞对PARP抑制剂奥拉帕尼表现出更高的敏感性，在ATM基因敲除细胞中重新引入FANCD2表达，可以恢复细胞的增殖能力。ATM基因敲除细胞揭示了ATM基因杂合性在神经母细胞瘤中的作用机制，并阐明了ATM失活如何增强NB细胞对奥拉帕尼治疗的敏感性，对治疗显示ATM基因剂量和侵袭性癌症进展的高风险NB患者具有重要意义。
文献支持
CRISPR-Cas9基因敲除细胞株构建服务（单基因敲除/多基因敲除/移码突变/片段敲除）
￥6980
