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CRISPR-Cas9/基因敲
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艾迪基因
基因编辑服务
株
基因敲除原理CRISPR是一种来源于细菌免疫系统的基因编辑技术,能精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸序列,利用核酸内切酶蛋白对DNA靶点序列进行切割,产生双链DNA断裂,断裂将在体内被细胞修复机制修复,其中,非同源末端连接NHEJ这种修复将产生短的核酸插入或删除,其带来的基因移码突变,将导致提前出现终止密码子,从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的敲除。在PAM片段上游设计sgRNA后,通过构建基因敲除载体,结合慢病毒系统,可以实现外源基因的整合,利用抗生素或荧光,最终筛选出成功实现基因敲除的细胞。CRISPR/Cas9基因敲除系统服务优势:(1)广泛适用于哺乳动物细胞,脱靶率更低(2)提高转染率,减低细胞毒性,缩短实验周期基因敲除细胞株的项目流程:(1)项目评估(免费)(2)细胞抗生素敏感浓度摸索与单克隆形成验证(3)sgRNA设计与敲除载体构建(4)慢病毒包装与转染(5)阳性多克隆筛选(6)阳性单克隆筛选(7)敲除验证基因敲除服务周期:根据细胞生长特性与基因不同,服务周期在5~10周不等。服务流程: 客户提供:靶细胞及其培养方案、基因名称交付标准:1×基因敲除阳性单克隆细胞株(复苏) 1×项目结题报告服务保证:(1)项目启动后,密切跟进实验进展,每两周进行一次项目进度汇报。(2)项目结题报告包含sgRNA序列、实验详细记录、测序结果及分析等,满足客户后期论证材料需求。(3)基因敲除阳性单克隆均经过靶标片段T载体克隆测序验证,保证基因敲除。
一、抗生素敏感浓度摸索将细胞如下图1稀释。给药7天后,弃培养液,用台盼蓝染色2 min,显微镜下观察细胞存活情况。确定细胞多克隆细胞筛选和单克隆细胞筛选浓度。 图1 抗性浓度摸索二、单克隆形成验证细胞计数,将细胞悬液稀释混匀后加入96孔板,用封口胶将孔板封好,放于培养箱中培养。静置培养48 h后每日观察并记录单克隆形成情况。三、靶标基因sgRNA 设计根据基因序列信息,设计 sgRNA。四、位点序列信息确认PCR扩增(图2),测序验证基因序列,以确定sgRNA区域有无SNP。 图2 靶标序列扩增五、敲除载体构建退火,连接,转化,涂板(LB/Amp)培养。每个实验组各挑取6个单克隆菌落,于LB/ Amp培养基中扩增,提取质粒,琼脂糖凝胶电泳检测质粒提取效果(图3)。 图3 质粒抽提酶切验证 :取3个单克隆酶切,琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果(图4)。选择2个样品送样测序。 图4 单克隆酶切验证六、慢病毒包装敲除载体无内毒素质粒提取,病毒包装。七、细胞转染配制梯度病毒稀释液,细胞于培养箱中静置培养48h。八、阳性多克隆细胞株筛选九、阳性单克隆细胞株筛选细胞转染48h后,更换完全培养基,筛选至对照组大部分细胞死亡,实验组细胞扩大培养,进行单克隆筛选。几天后挑选阳性单克隆进行扩增,并取样验证。十、阳性单克隆细胞株验证1、测序验证提取阳性单克隆细胞株的基因组,将靶标基因酶切克隆至T载体后测序,以确定是否敲除成功。结果示例:该基因有两个单克隆细胞株,A1和A2。(1)单克隆细胞A1的目的基因在sgRNA2位置出现两种突变形式,分别缺失1个和19个碱基,在新序列的第337位和第355位碱基提前出现终止密码子。(2)单克隆细胞A2的目的基因在sgRNA2位置发生突变,插入1个碱基,在新序列的第340位碱基提前出现终止密码子。
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