基因点突变背景:
人类有超过 75000 种疾病和遗传变异相关,其中单碱基突变占比最大,但目前大多数仍没有好的治疗方法。不管是遗传病还是癌症的检测与治疗,都需要点突变的细胞株。
基于 CRISPR-Cas的基因编辑技术曾被给予厚望,该技术可以在特定基因组位置产生双链断裂(double-strandDNA breaks,DSBs)后,使得外源正确供体基因序列得以通过同源重组的方式整合基因组,达到基因编辑的目的。然而,CRISPR-Cas基因一直饱受脱靶效应困扰,并且引入双链断裂也造成多余副产物、基因转座等问题,限制其在基因治疗领域发挥更重要的作用。
目前无需双链断裂的基因编辑技术仅能实现4种单碱基编辑(C→T, G→A, A→G, T→C),仍有8种编辑不能实现(C→A, C→G, G→C, G→T, A→C, A→T, T→A, T→G)。
先导编辑系统采用了全新的基因编辑方法。借助Cas、反转录酶和特殊设计的gRNA(prime editing guide RNA ,pegRNA),实现精确性和泛用性共存的基因编辑。
先导基因编辑技术原理:
先导基因编辑(PE)就是一个查找-替换的过程。
设计一个两端分别携带 gRNA 和基因编辑后模板序列的 pegRNA,pegRNA含有特异的引物序列(类似sgRNA)和先导编辑蛋白,特异的引物序列可以定位到特异的位点,先导编辑蛋白是cas9 nickase(切DNA单链)和逆转录酶的融合蛋白。pegRNA的引物序列引导 Cas9 nicknase 切割DNA单链,逆转录酶依照未配对pegRNA序列合成新的DNA序列,原位合成新的编辑后序列替代原有序列的过程。
PE 系统的组成包括先导编辑蛋白(cas 9 nickase、反转录酶)和 pegRNA。
Cas9 nickase是cas9 H840A nickase,可以切割DNA单链;反转录酶(reverse transcripase,RT)是M-MLV;融合后的蛋白可以提高基因编辑效率,被称作为PE1。通过引入RT的突变,提高模板链和引物结合位点的结合能力,进而提高没得活力和稳定性,可以讲PE的编辑效率提高2.3-5.1倍,这被称为PE2。
pegRNA一段包含逆转录模板的向导RNA和基因组序列互补的部分作为引物结合位点,引物结合位点和目标序列结合的位置作为逆转录的起始位点。
该技术的用途:
(1)构建疾病模型
(2)疾病检测用标准DNA细胞株
技术优势:
(1)不引入双链断裂和供体 DNA 模板。
(2)实现包括目标插入,缺失和所有 12 种类型点突变。
(3)编辑效率高。
操作流程:
1.设计一段带有转录模板(携带想要的基因信息)和必要 Prime Binding Site(PBS)的 PE 编辑专用 gRNA——pegRNA。
2.Cas9切口酶在pegRNA上的sgRNA序列指引下,切割DNA单链,pegRNA 3′-端的PBS(引物结合序列)可以与切割断点前的互补序列识别配对
3.逆转录酶(M-MLV RT)以pegRNA上PBS序列后的人工设计的模板序列为模板进行逆转录,将目标序列直接聚合到切口的DNA链上
4.编辑后的 DNA 双链延伸出一段额外新合成的 DNA Flap,启动细胞自有的 3‘flap-5’flap equilibration 机制,将 DNA 原有的片段切除。
5.不匹配的 DNA 双链通过错配修复(mismatch repair,MMR)机制,把非编辑链修复,整个编辑过程就完成了。
客户提供
细胞、基因名称 、点突变位置
交付标准
1×基因点突变的单克隆细胞株(纯合子或者杂合子)、1×项⽬结题报告