- ￥6880
- 过表达周期短，价格实惠，实验不成功不收费，有多名博士免费评估
- 广州
- 2025年10月16日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 提供商：
艾迪基因
- 服务名称：
基因编辑服务
- 规格：
株
| 细胞类型 | 各种细胞类型，包括肿瘤、常规、干细胞、原代和永生化细胞系 |
|---|---|
| 服务类型 | 慢病毒稳转细胞系/转座子稳转细胞系 |
| 交付标准 |
1）基因过表达多克隆细胞pool（2管细胞/株，1×106/管） 2）基因过表达单克隆细胞≥1株（2管细胞/株，1×106/管） 3）实验报告 |
| 周期 | 现货1周（查看现货）；定制快至4周 |
| 价格 | 6880元起 ；具体可来电咨询18102225074 |
一、过表达载体构建
利用同源重组的方法构建LentiCRISPRv2-GOI过表达载体，采用双酶切的方式获得线性化载体，根据同源重组设计目的片段的引物。目的片段的获得分为两步PCR方法，第一步从模板中扩增出目的片段的ORF，第二步扩增加入Gsg-3×FLAG序列。采用one step cloning试剂盒连接目的片段与线性化载体，利用Amp进行抗性筛选。
1、基因序列扩增（图1）
图1 基因序列第一轮扩增
2、基因序列扩增，添加标签及同源序列
3、双酶切pLentiCRISPRv2载体
4、目的基因与线性化载体连接
利用ClonExpress II one step coloning Kit连接目的片段和线性化载体。每个实验组各挑取单克隆菌落，于LB/ Amp培养基中扩增，并送样测序。
5、LentiCRISPRv2-GOI无内毒素质粒提取
二、病毒包装
1、培养细胞，配制PEI-Opti-MEM和质粒混合液，将PEI-Opti-MEM加入各质粒混合液中，轻弹管壁混匀，室温静置孵育15～20 min。
2、将上混合液小心滴加到培养基中，轻轻晃动摇匀，在培养箱中继续培养18 h。
3、18 h后小心吸去培养基，加入5 mL新配制的完全培养基。
4、42 h后收集培养上清，离心，0.45µm滤膜过滤，液氮速冻，-80℃保存。
三、细胞转染
1、配制梯度病毒稀释液
2、在六孔板中加入病毒稀释液，随后立即加入细胞，摇匀，以下每孔依次按此操作进行。细胞于培养箱中静置培养48 h。
四、阳性多克隆细胞株筛选
五、阳性单克隆细胞株筛选
1、细胞转染48 h后，更换完全培养基，随后1～2 d更换一次。
2、筛选7天后，对照组细胞全部死亡，实验组细胞扩大培养，同时进行单克隆细胞筛选。
3、96孔板每孔加100 μL细胞悬液，用封口胶将孔板封好，放于培养箱中培养
静置培养48 h后，更换完全培养基，随后1～2 d更换一次，每日观察并记录单克隆形成情况。
六、阳性单克隆细胞株验证
1、测序验证
提取单克隆细胞株基因组DNA，测序验证基因稳定转染单克隆细胞株的基因序列的准确性
2、Western blot或qPCR
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文献和实验
