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CRISPR/Cas9基因敲除
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/病毒
本技术服务提供基于CRISPR/Cas9技术的目的基因敲除用慢病毒或目的基因敲除的指定细胞株,并且无论是慢病毒和细胞株都经过金标准T7E1法的验证。特别是目的基因敲除的多克隆细胞株,仅需30天即可获得并可用于目的基因敲除后的功能检测。
基于CRISPR/Cas9技术的X基因敲除细胞株的构建
图2. sgRNA切割靶基因DNA活性检测和筛选。图中显示sgRNA1和sgRNA3有较强的切割活性,而sgRNA2的切割活性很弱。
图3. 基因敲除细胞的T7E1法验证。敲除位点上下游设计PCR引物,提取细胞基因组DNA后进行PCR扩增。对PCR产物进行变性和退火处理后加入T7E1 (核酸内切酶,只切割碱基错配的DNA),敲除(knockout, KO)细胞的PCR扩增产物经T7E1消化后可见明显的切割条带,说明预期的敲除位点附近存在大量sgRNA引导Cas9切割形成的缺失突变。
图4. 目的基因敲除的Western验证。筛选获得的阳性细胞传代2次后,取细胞制备蛋白样品,每孔的蛋白上样量为20μg。用抗目的蛋白X的抗体进行检测,检测Actin作为内参。标示sgGFP的为感染了靶向GFP的慢病毒后筛选获得的细胞,标示sgX的为感染了靶向目的基因X的慢病毒后筛选获得的细胞。
图5. 在诱导细胞死亡的条件下,只有敲除基因X的细胞可以存活。原始细胞(naive)及阴性对照细胞(sgGFP)约80%死亡。
图6. X基因敲除影响蛋白M的磷酸化。X基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中蛋白M被特定处理诱导的磷酸化被完全抑制(A)。在通过CRISPR/Cas9技术X基因敲除的细胞中进行相同的实验,实验结果与MEF结果一致(B)。
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