stop-Cas9 工具鼠 小鼠模型 基因编辑小鼠

 

Rosa26-CAG-LSL-Cas9-tdTomato 验证报告 I

 

1. 构建方案

 

图一 Rosa26-LSL-Cas9-tdTomato 小鼠构建方案

小鼠的 Rosa26 基因座(Friedrich and Soriano, 1991)被证明能够稳定表达整合到此位点的外源基因，已被广泛地用于制作各种敲入及 Gene Trap 小鼠。我们将 CAG 启动子(Niwa et al., 1991) 驱动的 Cas9 表达元件插入到 Rosa26 位点，并在 CAG 与 Cas9 之间放置两侧带有 loxP 的 STOP 元件，以阻止 Cas9 表达，另外在 Cas9 后面还融合了红色荧光标记 tdTomato，以方便检测Cas9 表达情况。当存在 Cre 重组酶时，Cre/loxP 重组切除 STOP 后即可开启 Cas9 表达，并可以通过红色荧光检测到。

 

2. 表达检测

 

为测试 Rosa26-LSL-Cas9-tdTomato 小鼠的 Cas9 表达情况及切割活性，我们分离了 MEF 细胞进行体外转染 Cre+sgRNA 测试。将基因型为 Rosa26-LSL-Cas9-tdTomato KI/flper 的 515#雌鼠及 397#雄鼠交配，取 E13.5 天胚胎分离 MEF 细胞，经鉴定确认分离得到的 MEF 细胞基因型为 KI/flper。

我们使用 Lonza Nucleofector™ 2b Device 进行 MEF 转染，转染使用的质粒为 pCAG-Cre:GFP 及U6-GPR50-S51，由于 Cre 与 GFP 融合，Cas9 与 tdTomato 融合，转染后通过观察绿色荧光和红色荧光即可获知 Cre 及 Cas9 的表达情况。转染后，收集细胞，提取基因组 DNA 进行 PCR 检测，通过 PCR 产物 T7E1 酶切实验可以获知 Cas9 对 sgRNA 靶点的切割情况。

转染实验分 5 组（TABLE 1），组 1A-1C 为 Cas9+sgRNA 共转染组，转染的 Cre 及 sgRNA 质粒总量分别为 2ug+4ug, 1ug+2ug 及 3ug+6ug；组 2 只转染 2ug Cre 质粒；组 3 只转染 4ug sgRNA 质粒。

TABLE 1 MEF 电转染实验分组及结果

 

实验分组	转染质粒		转染结果
	pCAG-Cre-GFP	U6-GPR50-S51	绿色荧光	红色荧光	DNA 切割
组 1A	2ug	4ug	有	有	有
组 1B	1ug	2ug	有	有	有
组 1C	3ug	6ug	有	有	有
组 2	2ug	0	有	有	无
组 3	0	4ug	无	无	无

结果显示（图二~七），组 1A-1C 均能观察到绿色荧光和红色荧光，并且，T7E1 检测显示，Cas9

 

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对 sgRNA靶点进行了明显的切割；组2 能观察到绿色荧光和红色荧光，但未检测到Cas9 对 sgRNA

 

靶点切割；组3 未检测到绿色或红色荧光，也未检测到Cas9 对 sgRNA靶点的切割。

我们选择18h, 24h,48h 和66h 这4 个时间点观察荧光，发现绿色荧光在18h 最强，随着时间延长渐渐变弱，到66h 已经几乎观察不到；而红色荧光在则在18h 不可见，24h才开始出现，48h最强，66h开始变弱，绿色和红色荧光的变化与Cre 及Cas9 的表达顺序一致，当质粒通过转染进入细胞后，Cre被表达出来即可观察到绿色荧光，Cre切除rosa26 位置的loxP-STOP-loxP，开启Cas9的表达，才可以看到红色荧光，因此，红色荧光出现的时间应当比绿色荧光出现时间晚。T7E1切割检测显示，组2 及组3 都未发生Cas9 切割，证明在缺少Cre 或sgRNA 时，均不会发生Cas9切割。表达检测结果与BROAD 研究所的张锋博士实验室制作的Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 小鼠一致。

图二 T7E1酶切鉴定

T7E1 酶切鉴定结果显示，共转染了Cre和sgRNA质粒的1A1B 1C三组DNA都发生了Cas9对sgRNA靶点的切割，而单独转染Cre 质粒（组2）或单独转染sgRNA 质粒（组3）的两组与B6（阴性对照）一样，未检测到Cas9 切割。

B6: C57BL/6J genomic DNA, W: blank control, DL: DL2000 DNA Marker

 

 

图三 组2 Transfectedwith pCAG-Cre:GFP

转染质粒为pCAG-Cre:GFP（2ug），Cre-GFP表达后可观察到绿色荧光，而Cas9-tdTomato则需要Cre/loxP反应切除STOP元件后才能开启表达，出现红色荧光，因此，红色荧光出现的时间应当比绿色荧光出现的时间要晚。实验结果与预期相符，绿色荧光18h 即出现，随着时间推移，绿色荧光渐渐消失，至66h 已不可见；24h 开始出现红色荧光，48h荧光增强，66h红色荧光减弱。

 

 

图四 组3 Transfectedwith U6-GPR50-S51

转染质粒U6-GPR50-S51（4ug），由于无Cre表达，观察不到绿色荧光，不能切除loxP-STOP-loxP，无法开启Cas9 表达，观察不到红色荧光。实验结果与预期相符，未观察到荧光。

 

 

图五 组1A Transfectedwith pCAG-Cre:GFP(2ug)+U6-GPR50-S51(4ug)

转染质粒为pCAG-Cre:GFP（2ug）+U6-GPR50-S51（4ug），Cre-GFP表达后可观察到绿色荧光，而Cas9-tdTomato则需要Cre/loxP反应切除STOP元件后才能开启表达，出现红色荧光，因此，红色荧光出现的时间应当比绿色荧光出现的时间要晚。实验结果与预期相符，绿色荧光18h 即出现，随着时间推移，绿色荧光渐渐消失，至66h 已不可见；24h开始出现红色荧光，48h荧光增强， 66h红色荧光减弱。

 

 

 

图六 组1B Transfectedwith pCAG-Cre:GFP(1ug)+U6-GPR50-S51(2ug)

转染质粒为pCAG-Cre:GFP（1ug）+U6-GPR50-S51（2ug），Cre-GFP表达后可观察到绿色荧光，而Cas9-tdTomato则需要Cre/loxP反应切除STOP元件后才能开启表达，出现红色荧光，因此，红色荧光出现的时间应当比绿色荧光出现的时间要晚。实验结果与预期相符，绿色荧光18h 即出现，随着时间推移，绿色荧光渐渐消失，至66h 已不可见；24h开始出现红色荧光，48h荧光增强， 66h红色荧光减弱。

 

 

图七 组1C Transfectedwith pCAG-Cre:GFP(3ug)+U6-GPR50-S51(6ug)

转染质粒为pCAG-Cre:GFP（3ug）+U6-GPR50-S51（6ug），Cre-GFP表达后可观察到绿色荧光，而Cas9-tdTomato则需要Cre/loxP反应切除STOP元件后才能开启表达，出现红色荧光，因此，红色荧光出现的时间应当比绿色荧光出现的时间要晚。实验结果与预期相符，绿色荧光18h 即出现，随着时间推移，绿色荧光渐渐消失，至66h 已不可见；24h开始出现红色荧光，48h荧光增强， 66h红色荧光减弱。

 

 

3. 结论

 

分离rosa26-LSL-Cas9-tdTomato小鼠的MEF 细胞在体外转染Cre 表达质粒，该模型可在Cre/loxP切除STOP 元件后开启Cas9 及tdTomato表达；在共转染Cre 表达质粒及guide RNA表达质粒时，可同观察到红色荧光，并检测到靶基因的切割。根据实验结果，可判定该模型制备成功。但是，由于转染效率较低，本次实验观察到的荧光信号较弱。

 

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