miRNA测序及分析

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miRNA测序及分析

　　MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过 Dicer酶加工后生成。目前研究microRNA的方法主要是通过实时定量PCR以及基因芯片技术，这些方法主要关注microRNA的表达与定量，并 仅局限于研究那些序列信息或二级茎环结构信息已知的microRNA，无法寻找和发现新的microRNA分子。基于Illumina高通量测序平台的 microRNA测序技术突破了目前研究技术手段上的局限性，使研究人员能够直接对样本中指定大小的所有microRNA分子进行高通量测序，在无需任何 序列信息的前提下研究microRNA的表达谱并在此基础上发现和鉴定新的microRNA分子，并提供了更加灵活和深入的研究分析方法。

一、技术路线

二、数据分析

1.序列去杂（去除接头序列、简单序列等）

Rfam数据库以及Genbank数据库比对，去除rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的降解片段

鉴定mRNA的降解片段

同miRNA数据库比对，鉴定miRNA

同参考基因组比对，预测新的miRNA

分析两个样品miRNA的表达差异

miRNA表达模式聚类分析

预测miRNA靶基因

三、实验周期

　　由于合作伙伴的个性化需求不同，实验的周期也各不相同。从获得合作伙伴样品、高通量测序到数据分析，一般控制在30到40工作日内完成。

四、常见问题解答

1. 进行小RNA测序对于组织样品提取总RNA有什么特殊要求？

答：如果要进行小RNA测序，提取总RNA时建议不要使用Qiagen等公司的过柱试剂盒，也不要使用LiCl沉淀，以免损失小片段RNA。除此之外也可以使用专用小RNA提取试剂盒来进行提取。

2．miRNA分析需要合作伙伴提供参考序列吗？

答：需要，最好提供合作伙伴所做物种的全基因组序列，如果没有，也可以提供近缘物种的全基因组序列或者是本物种的EST等序列作为参考序列，另外还需要老师提供相关的exon/ intron, repeat信息以及基因编码序列。

3．为什么不同的样品测序得到的reads数量相差较大？为什么说不影响分析准确性？

答：不同类型的细胞在不同时期表达的基因数差异很大，而通常用作total RNA提取的材料的细胞数差异也很大（通常为10～100万个细胞），所以取材的时空及细胞总数的多少决定了样品中表达的mRNA的总量不可能完全一致。 Reads数与样品上机浓度、样品GC含量和样品自身特性相关，不同样品间存在的差异是正常的。Reads数只会影响到数据量，数据量足够分析就可以，不 影响准确性。同时，我们分析时采用RPKM标准化后的数据，这样即使reads 数量相差较大，也不影响分析的准确性。

五、相关案例

1. 芯片与新一代测序对小RNA的分析方法比较

　　来自丹麦的THOMAS LITMAN教授等人通过测序数据比较芯片与新一代测序方法。

　　图1 比较的数据；(A,B)为样品信号与RNA浓度百分之九十五的置信区间的相关性；(C)为Illumina公司sequencing和microarray比率；(D)柱状图为合成RNA在每个浓度的错误发现率，柱条越低，敏感性越好。

2. 小RNA测序在人体胚胎干细胞的应用

2.1 两个样本的microRNA差异表达分析。

　　利用数学统计的方法对不同样品间的microRNA进行差异显著性分析

　　图2 左边箱线图（图A）表示8大类的小RNA在人类胚胎干细胞小RNA文库的相关表达。其中miRNA是表达最高的一类。右图为两个文库所有已确定的 miRNA不同表达值的对数平方根最高值（黑色为正常值），白色柱为在至少一个文库中检测到没有不同表达的miRNA的对照组。

2.2 与数据库进行比对注释miRNA

　　图3 microRNA及其它不同种类的RNA分子所占比例统计。将得到的序列分别与miRBase数据库、mRNA/EST数据库、rRNAetc等数据库进行序列比对，鉴定出已知的microRNA。

2.3 预测新的microRNA

　　MicroRNA前体的标志性发夹结构能够用来预测新的microRNA。将测序得到的序列比对到该物种的基因组后，截取附近区域的一段序列，通过折叠模型分析，如发现该序列位于茎环结构上，则初步判定该序列为一个候选的新microRNA(图4)。

　　图4 新microRNA的预测

2.4 MicroRNA的表达模式聚类分析

　　表达模式相似的microRNA通常提示功能的相关性。表达模式聚类分析把表达模式相似的microRNA聚到一起，便于筛选出感兴趣的类别。

　　图5 人体胚胎干细胞的miRNA。红色表示上调，淡黄色色表示下调，白色色表示在样品中未表达的microRNA。

六、相关文献

1. Ryan D. Morin, Michael D. O'Connor, et al. Application of massively parallel sequencing to microRNA profiling and discovery in human embryonic stem cells. Genome Res. 2008 18: 610-621.

2. Hanni W, Jesper S, Rolf S, et al. Quantitative miRNA expression analysis: Comparingmicroarrays with next-generation sequencing. RNA (2009), 15:2028–2034.