测序常见问题及其分析（图）

1、PCR 产物测序时出现重叠峰

问题图1【模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码】

图1-1

解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。

问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）

解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。

问题图3（测序引物有碱基缺失）

图3

测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'''端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。

解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化。

2、克隆测序时出现峰形重叠

原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染。

解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。

3、样品有杂合/突变位点

模板中有杂合型突变，也就说模板本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。如果模板有杂合（突变或缺失），那么测序图形中其他的位点一般都是单一的峰形，然后突然在某一个位点出现重叠峰（如图中箭头所示）。

解决方法：建议将DNA片段克隆到载体再测序。

4、polyA/T 和C/G cluste导致的套峰和测序信号衰减

RACE测序时经常遇到图4-1和图4-4的情形，解决方法：从另一端测序；但如果这样的序列出现在中间，目前还没有很好的解决方法，要看测序公司的本事了。

C/G cluster在PrV基因组测序时遇到过。后来还是让TaKaRa公司给解决了，虽然不喜欢鬼子，但有时候却不得不用它们的产品和服务。

5、基因中含有重复序列

可能的原因：样品中含有重復序列导致的测序结果和PolyA/T的结果一样，会导致Frame滑动，较短的重復序列会导致测序结果出现移码；而较长的重復序列会使定序信号衰减。

解决办法：反向测序有时能够顺利的通过重復序列区域（但不是一定都能够），通过多次的测序结果比对，拼接可以得到全序列结果。