实验试剂及仪器具体要求见「其他」。
1. 贴壁细胞培养:
1.1 实验前约 1 h,将待标记细胞的培养液换为含有 20 mmol/L HEPES 的平衡培养液。重新放入培养箱,用新培养液平衡细胞。
1.2 将细胞培养皿置于 37℃ 水浴中 10 min, 再次平衡细胞。吸弃皿中培养液,用 10 ml 37℃ 预热的胞外缓冲液迅速冲洗细胞 2 次,吸尽胞外缓冲液,加 0.5~2 ml 的有渗透性的缓冲液于培养皿中。对有些贴壁性较差的细胞,在清洗时要多加小心。
1.3 加链球菌溶血素 O (60 U/ml 工作液)于每块培养皿中,终浓度 0.6 U/ml。按终浓度 100 mmol/L 加入预冷的 ATP 溶液(10 mmol/L 储存液)。
1.4 37℃,培养细胞 1~5 min。培养时间取决于研究系统和细胞类型,应根据经验确定。
1.5 加入 10 mCi/ml [γ-32P] ATP, 使终浓度达到 50~500 μCi/ml。
1.6 按研究需要加入药理试剂、多肽或 Fab'片段等相关试剂,必要时加入受体激动剂,并按需求制订它们的作用时间。
1.7 贴壁细胞培养。迅速吸尽有渗透性的缓冲液,加入 0.75 ml 预冷 2 × 裂解缓冲液,以停止反应,准备进一步的免疫沉淀。加入蛋白酶抑制剂和 DTT (储存溶液),溶液各组分的终浓度为: 1 mmol/L PMSF 1 mmol/L 苯甲酸 5 μg/ml 抑肽素 A 5 μg/ml 亮抑蛋白酶肽 5 μg/ml 抗蛋白酶 1 mmol/L DTT 将培养板置于冰上,10 min,然后用细胞刮片从板底刮离细胞于缓冲液中。每板都必须更换新刮片。
1.8 转移裂解液到带旋盖的微量离心管中(每管一个培养皿或一份细胞)。4℃,最大速度离心,将上清转移至带螺旋盖的新离心管中,在干冰/乙醇浴中快速冷冻,储存于 -70℃,备用(免疫沉淀)。
2. 悬浮培养:
2.1 实验前约 1 h,转移细胞至 50 ml 无菌离心管中,1000 g,室温离心 5 min。弃上清,用 40 ml 37℃ 的胞外缓冲液冲洗细胞 2 次,1000 g,室温离心 5 min,弃上清。 如果需要,在加入最终的胞外培养液后,细胞悬液可按等份分开。如下操作:在最后加入 40 ml 胞外培养液后轻轻重悬细胞,并将细胞按等份分入新管中,离心,移出并弃去上清,在进行步骤 2.2 前完成清洗过程。
2.2 以 1 × 107 细胞/ml 的浓度将细胞重悬于 37℃ 的胞外缓冲液中,37℃ 下通过轻柔的涡旋平衡细胞 15~30 min,再次室温 1000 g 离心 5 min,吸尽缓冲液。 如果实验中使用较敏感的细胞(如血小板),这一步骤应被修正:平衡时间可减至 5~10 min,涡旋细胞的步骤也可省略。
2.3 按 0.6 U/ml 的终浓度将链球菌溶血素 O (60 U/ml 工作溶液)加入新配制的 37℃ 有渗透性的缓冲液,加入预冷 ATP 溶液(10 mmol/L 储存液),终浓度 100 μmol/L。 将含有链球菌溶血素 O 和 ATP 的有渗透性的缓冲液与细胞轻轻充分混匀。
2.4 37℃,培养细胞 1~5 min。
培养时间取决于研究系统和细胞类型,应根据经验确定。
2.5 加入 10 mCi/ml [γ-32P] ATP, 使终浓度达到 50~500 μCi/ml。
2.6 按研究需要加入药理试剂、多肽或 Fab'片段等相关试剂,必要时加入受体激动剂,并按需求制订它们的作用时间。
2.7 悬浮培养。加入等体积冰浴的 2 × 裂解缓冲液,停止反应,准备进一步的免疫沉淀,加入蛋白酶抑制剂和 DTT,溶液中各组分的浓度与 1.7 中相同。放置细胞在冰上,10 min。
2.8 转移裂解液到带旋盖的微量离心管中(每管一个培养皿或一份细胞)。4℃,最大速度离心,将上清转移至带螺旋盖的新离心管中,在干冰/乙醇浴中快速冷冻,储存于 -70℃,备用(免疫沉淀)。
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