标签: 双向凝胶电泳 蛋白质 固相化pH 蛋白质与蛋白质组学实验指南第四章
双向电泳是研究蛋白质组学的一种有效方法。与单向电泳相比,它能从复杂的蛋白质混合物中分离出更多的成分。电泳时,蛋白质迁移速度取决于它们的分子形状、大小及所带电荷多少,双向电泳利用后两项特征使蛋白质能够有效分离。[澳]理查德J.辛普森(RichardJ.Simpson)主编何大澄主译
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实验方法原理 | 肝与其他动物组织一样,可制备用作双向电泳的材料。离心之后,溶于合适的溶液中即可。不需要浓缩蛋白质或去除干扰物质等额外步骤。所用抽提溶液包括脲、硫脲和酰胺烷基硫代甜采碱去垢剂ASB-14,它们配合使用可最大量地溶解蛋白质。 |
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实验材料 | |
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仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1.取一些肝放入研钵中,如果事先没有被冰冻,可用液氮充满研钵来保持肝冰冻。用研杵将肝破碎成小块。 2.称量冰冻肝的小块 10~40 mg,将其转移至在冰上放置的离心小管中。操作应迅速以尽可能减少肝样品的解冻。将剩余的肝储存在一 80°C。 3.在有肝样品的离心管中,每 40 mg 肝加入 1ml 冷的抽提溶液。每 1ml 抽提溶液加 100 mmol/L PMSF。 4.用小研杵(其大小适合在离心管中使用)磨碎肝样品。 5.每 1ml 抽提物中加 50ul 1.2mol/L DTT,振荡。 6.在 4°C 对样品进行最大速度离心,lOmin。 7.检测上清的蛋白质浓度。 8.将上清分成每 100ul —份。若不立即用于 IEF,将其储存在一 80°C(样品只能冻融一次,以避免多次冻融造成的不利影响)。 9.按照方案 5 进行第一向 IEF。 进行第一向 IEF 时,以鼠肝为例,浓度应为 5~lOmg/ml。对第一向 IEF,样品可在包含 7mol/L 脲、2mol/L 硫脲、20 g/LASB-14 的水化液中被稀释成准确浓度。但是,若在水化的同时上样,IEF 胶条可负载相当大体积的样品。最适水化溶液可根据蛋白质来源和经验而灵活决定。
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实验方法原理 |
在生物医学研究中,培养的哺乳动物细胞是被广泛使用的材料。本方案中介绍的方法已经成功用于许多人类克隆的癌细胞系和纤维原细胞系(Ji,etal,1994,1997)。虽然多数细胞蛋白质能用此方法提取,但是一些 DNA 结合蛋白可能会丢失。 如果研究 DNA 结合蛋白,应该使用核酸酶,此方法在方案 3 中详述。表达蛋白质组学的研究经常需要检测低丰度蛋白质,一种检测微量蛋白质的更可靠、更敏感的方法是对细胞蛋白质进行代谢物放射性标记,此方法的详细介绍见附加方案:用放射性同位素标记真核生物细胞蛋白质。具体步骤详见本方案的最后。
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1.从培养皿中转移细胞。. 如果是贴壁细胞,用细胞刮刀从培养皿中刮下细胞,用 5 ml 吸管将细胞和培养基转移到 15 ml 离心管中。 如果是悬浮细胞,直接将细胞和培养基转移到离心管中。 2.480 g、4°C,离心沉淀细胞 5 min。 3.弃去上清,勿搅动沉淀。
4.在离心管中加 IOml 冰冻 PBS 洗涤细胞,来回吹打重悬细胞。 5.480 g、4°C,再次离心细胞 5 min。 6.弃去上清,勿搅动沉淀。 7.重复步骤4~6两次。 8.在最后一次洗涤后,把离心管完全空干,用滤纸将沉淀上残留的 PBS 吸干。 9.用吸管将抽提缓冲液加到离心管中。 依赖所研究的细胞系来确定抽提缓冲液的体积。细胞裂解液的蛋白质浓度应为 10 mg/ml,不应超过 20 mg/ml。 10.旋涡混合器振荡离心管 10~30s,重新悬浮沉淀。 11.每 1Oml 抽提缓冲液中加 50ul IPG 缓冲液,IPG 缓冲液终浓度为 0.5%。 12.将细胞裂解液转移到一个合适的超速离心管中。 13.100000g 离心 20 min。 14.收集上清,小心避免试管底部的清澈黏性的液滴(DNA 和 RNA) 混入上清。 15.用 BCA 方法测定蛋白质浓度(见附录 2)。
16.将上清分成几等份,每份 lOOjtxl 或 200 沁。 每一等份的大小取决于待测样品的量。如果不立即用于 IEF,将样品储存在一 80°C。 17.按方案 5 进行第一向 IEF。
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实验方法原理 |
细菌裂解液含大量核酸,在进行双向凝胶电泳之前,需先对核酸进行处理。可通过超声波处理包含脲和 CHAPS 的细菌提取液。当脲存在时,核酸酶(Benzonase) 是有活性的,但是其活性依赖于 Mg2+。核酸酶处理后加入 EDTA 以抑制金属蛋白酶活性。
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1.将培养基装人质量已知的瓶子或管子中,12000 g、4°C 离心 5 min,以沉淀大肠杆菌。 2.弃去上层清液,完全吸干离心管。称量瓶子或管子的毛重,去除皮重以确定大肠杆菌的重量。 3.在冷抽提液中重悬沉淀,每 1g 细胞用 1Oml 抽提液。将细胞悬液转移到塑料圆锥形离心管中。每 1Oml 抽提液加 1 ul (500U)Benzonase 和 100ul 100 mmol/L PMSF。每加人一次液体之后都要上下颠倒混匀。将试管放在盛有冰的烧杯内。 4.在细胞悬液中,用超声波处理细胞。将超声波仪的输出功率设定为最大值。每 15s 进行一次超声处理,每次超声处理之后冷却细胞悬液,重复多次直到细胞悬液清澈。 5.每 1Oml 提取液中加0.5 ml 1.2mol/L DTT,颠倒混匀,将试管在冰上放置 15 min。 6.每 1Oml 提取液中加 100 ul 200 mmol/L Na2EDTA, 颠倒混勾。 7.将裂解液转移到离心管中,20000 g、4°C 离心 15 min。 8.测定上清液中的蛋白质浓度。 9.将上清液分成若干份,每 lOOul 为 1 等份。如果不立即用于 IEF,将其储存在-80°C,避免多次反复冻融造成的副作用。 10.依方案 5 的步骤来完成第一向 IEF。对于第一向 IEF,蛋白质浓度应为 5~10 mg/ml。样品可用水化液稀释到准确浓度。
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实验方法原理 | 可用乙醇沉淀人类脑脊液以浓缩其中的蛋白质和除去盐分,否则这些物质会干扰第一向 IEF。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1.在室温下解冻脑脊液样品。当样品解冻后,旋紧试管盖,再用旋涡混合器振荡试管。 2.样品溶解时,在 15 ml 离心管及盖上标记所处理样品的名称 3.将 1 ml 脑脊液和 9 ml 乙醇加人 15 ml 离心管中混合。
4.将离心管的盖拧紧,振荡,-20°C 储存过夜。 5.5000 g 4°C,离心 5 min。 6.将上清倒入指定的废物缸。在不吸出沉淀的前提下,用 200ul 吸头尽可能转移走剩余的乙醇,不让吸头接触沉淀。 7.将离心管放在通风橱在空气中干燥 10~20 min,但不能让沉淀彻底干燥。 8.在每个试管中加人 100ul 增溶溶液,加 24 泠巯基乙醇,旋紧试管上的盖,用旋涡混合器振荡试管,在室温下放置 30 mm。 9.超声处理样品 30s。 10.5000 g、4°C,离心 5 min。 11.将每份上清液转移到新试管中,检测每份上清的蛋白质浓度。 蛋白质浓度会随脑脊液样品的不同而变化,但是使用 25W 的这种溶液,就能通过银氨染色的双向凝胶电泳有效检测到蛮白质。 12.若样品不立即用于 IEF,将其按每份 100ul 分装,储存在一 80°C。样品的冻融只能进行一次,以避免多次反复冻融所产生的副作用。 13.继续按方案 5 进行第一向 IEF。
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实验方法原理 |
这里所描述的分离蛋白质的两种方法都是基于蛋白质所带净电荷的多少,使用固相化的 pH 梯度凝胶进行的 IEF 技术。这些方法作为双向凝胶分离的第一向,除了利用传统的水平电泳仪进行 IPG 凝胶的等电聚焦外(方案 5 方法 A),还能在自带的电泳槽里使用 IPG 凝胶进行等电聚焦(方案 5 方法 B)。应用这些高电压系统进行 IPG 凝胶操作要求的步骤少,可减少出错概率,避免胶条混合和杂质的污染,以及空气的接触或脲结晶的产生。因为水化和 IEF 能在一个电泳仪内连续完成,这两步操作无需人的看管,过夜即可完成。电泳仪提供的高电压使蛋白质的快速分离和准确聚焦成为可能。IPG 凝胶能在实验室中灌制(近期的综述见 Gianazza,1999),但这很费时,也会产生其他问题。因此,以下方案所用的是购买的预制 IPG 脱水胶条(例如 Am-ershan Biosciences,Bio-Rad 和 Genomic Solution)。
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、IPG 胶条的水化1.在新制备的或温和解冻的水化液中加 DTT 至终浓度为 2 g/L。加两性电解质载体或 IPG 缓冲液至终浓度为 0.5%~2.0%。其 pH 范围与用于分析的 IPG 胶条的 PH 范围相匹配。 2.若在水化期间将蛋白质样品加到凝胶上,则将样品用水化液稀释(或溶解)至每胶条含 Img 总蛋白。 上样量取决于实验的目的。高丰度蛋白质上样量较小,低丰度蛋白质上样量较大。 3.在 IPG 胶条的塑料支持物背面标上样品名称。 4.在溶胀槽里加入适量的水化液(见表 4.2)。将溶液缓缓加人槽中心,要避免产生飞泡,除去气泡。记录不冋样品所对应的 IPG 凝胶。可将溶胀槽标号以便确认胶条。 5.从每个胶条上除去保护膜,胶面向下放置于水化槽中。确保溶液浸没整个胶条表面。如果有必要,用镊子将胶条末端夹起,来回滑动胶条来保证其完全湿润。避免在胶条下产生气泡。如果使用 IEF 方法 B,就要确保胶条和胶槽底面的电极丝接触。 6.在上面加 1.5 ml 矿物油来防止脲沉淀。将矿物油滴人胶槽一端直至半满,接着在另一端将矿物油加满,不要让矿物油溢出。 7.室温下,胶条水化至少 6 h(最好过夜)。如果采用下述的 IEF 方法 B,要将塑料盖子盖在胶槽上面。 8.用下述的方法 A 或方法来进行蛋白质的等电聚焦。 二、蛋白质的等电聚焦(IEF)方法 A: 在多功能水平电泳仪上进行蛋白质 IEF1.按照说明书,装配 2D 电泳仪和温度控制仪。 2.切两根长度合适的电极丝,用 Iml 水将每个胶条浸湿,然后将多余的水分用滤纸吸干。 胶条上过多的水可能引起蛋白质的拖尾。 3.按照说明书,将 IPG 胶条和电极丝放入电泳装置中。 4.(可选)若水化时没有上样,则应按照说明书用加样杯上样。 必须通过实验决定每种类型样品的最佳上样方式。酸性 pi 值的蛋白质或使用 SDS 溶解的样品最好在阴极上样。碱性很强的蛋白质需要在阳极上样。 用加样杯上样的蛋白样品可能会在加样处产生沉淀,导致凝胶的上样量减少,为此应稀释蛋白溶液。稀释液含有脲、非离子变性剂和两性载体电解质。在开始电泳时,使用低电流,样品可缓慢进入胶条,这有助于减少样品在上样处的聚集。 5.将电极和电源连接,按所需参数对电源进行设置。 典型的 IEF 方案是使电压逐渐升高到所需聚焦电压,再维持几个小时。 聚焦电压的持续时间受许多因素影响,包括 IPG 胶条长度、PH 梯度、样品成分、上样量和水化溶液成分,而且必须通过实验确定。表 4.3 提供了分析蛋白质样品的建议条件。 在总量低于 100000 V*h 下很少发生过度聚焦的问题。但是,当电泳时间很长时,它可能会造成水平拖尾,特别是在凝胶的碱性末端。 6.打开电源开关开始电泳。如果可能,确保使用低电流检测。 7.在电泳结束时,关闭电源,打开电泳槽的盖子,按操作说明处理胶条。 8.用镊子夹起胶条,吸干胶条上的矿物油,放在平衡管中。对每块胶条都重复此步骤。 9.进行第二向电泳步骤(方案 6~9) 或将胶条放在试管中,储存在一 40~80°C。 胶条能储存 1 个月。 方法 B: 用 IEF 专用电泳装置进行蛋白质 IEF1.对 IEF 的电泳装置设置程序。 典型的 IEF 方案是使电压逐渐升高到所需聚焦电压,再维持几个小时。 聚焦电压的持续时间受许多因素影响,包括 IPG 胶条长度、PH 梯度、样品成分、上样量和水化溶液成分,而且必须通过实验确定。表 4.4 提供了分析蛋白质样品的建议条件。 在总量低于 100000V*h 下很少发生过度聚焦的问题,但是当电泳时间很长时,它可能造成水平拖尾,特别是在凝胶的碱性末端。由于样品类型的不同,一些样品可能在电泳过程中不能达到最大电压。因此,在总 V?h 数值的基础上,对电泳条件进行设置是最好的方法,而不是通过设置时间来实现合适的聚焦。 2.盖上电泳槽的盖子,开始进行等电聚焦电泳(IEF)。 3.电泳结束后,关闭电源,打开电泳槽的盖子。 4.用镊子夹起胶条,控干胶条上的矿物油,放在平衡管中。对每块胶条都需重复此步骤。 5.进行第二向电泳(方案 6、方案 7 和方案 9)。胶条放入试管中,储存于-40~-80°C。胶条能存放 1 个月。
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实验方法原理 |
蛋白质通过 IEF 进行分离之后,可进行第二向电泳,即 SDS-PAGE。本方案详细介绍了灌制均一 SDS-PAGE 凝胶的方法。均一凝胶(具完全相同的%T和%c) 对特殊分子量范围的蛋白质有较好的分离效果,因其灌制方法简单而被普遍使用。 第二向凝胶可按三种不同方式(如尺寸)方便地制备:小胶用于 7 cmIEF 第一向凝胶;标准胶用于 11 cm、13 cm 以及 18 cm IEF 第一向凝胶;大型胶用于 18~24 cm 的 IEF 第一向凝胶。这些凝胶所用的试剂见下述,但在设备上要求不同。 如果凝胶用银氨方法染色,凝胶中的硫代硫酸钠可减少染色的背景水平(方案 11)(HochstrasserandMerril,1998, 见表 4.5 的注释)。
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1.安装玻璃板之前,用乙醇浸过的无棉纸巾擦拭玻璃板,以确保无灰尘颗粒粘在玻璃板表面。
2.对齐两块玻璃板,在两边放入 1.0mm 或 1.5 mm 隔片。 3.用恰好足够的压力将两块玻璃板及隔片夹住,使其保持在适当的位置。将其底部立于水平面上,保证两块玻璃板底边及隔片相互齐平,锁紧夹子。 玻璃板的底边和隔片相互齐平是很重要的,这能降低灌制胶时泄漏的可能性。 4.将装配好的夹子装人灌胶架,转动旋钮以使胶框(即夹在一起的玻璃板和隔片)卡紧于支架的塑胶条上。 5.用打字机或铅笔标记一小条滤纸作为凝胶的标签。将滤纸放在凝胶框的左边底部,不要用标记笔,因其会溶出渗入凝胶。 6.用不脱色记号笔在玻璃平板外面离上沿约0.5 cm 处作标记。 7.在灌胶之前将水加人凝胶框来确定凝胶溶液的体积。在灌胶前从凝胶框中除去全部的水,否则凝胶中丙烯酰胺的浓度会受影响。在真空瓶中配制准确体积的凝胶溶液(由表 4.5 计算),TEMED 和过硫酸铵的体积忽略不计。 8.在溶液中加一个小磁力搅拌子,用水抽真空泵抽几分钟以除去溶液中的空气,在磁力搅拌器上搅拌溶液。 虽然并非所有研究者都进行抽空气这步,但为了更佳的重复性,建议进行此步操作。 9.在瓶中加 TEMED 和过硫酸铵,轻轻搅拌至混合,不要产生气泡。 10.用吸头缓慢加入凝胶 (从一个角落滴加),加至距上沿 0.5 cm。 11.立即在凝胶上方加一薄层(100~500ul) 水饱和的正丁醇以避免凝胶暴露在氧气中,并且可使凝胶表面平整。
12.让胶聚合至少 lh。 13.在聚合之后,检查每块胶是否完全聚合并且均一,同时检测胶的上表面是否水平。用双蒸水或去离子水清洗胶表面。 14.此胶可用于第二向电泳(方案 9),并可在 4°C 储存两周。 储存的胶应用胶储液覆盖,并且用塑料膜紧密缠绕好。
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实验方法原理 |
对于分离宽分子量范围的蛋白质,梯度 SDS-PAGE 凝胶可提供最佳分析方法,产生更清晰的蛋白质点。通过减少凝胶中孔的尺寸,可使扩散减少。但是,梯度凝胶重复性较差,所以通常用多凝胶灌制装置来同时灌制,制作一套凝胶来进行同一系列的实验。下面讲述用多凝胶灌制系统灌制梯度凝胶的方法。 如果凝胶要用银氨方法(方案 11) 来染色,凝胶中的硫代硫酸钠可减少染色背景(HochstrasserandMerril,1988; 见表 4.6 注释)。
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1.安装玻璃板之前,用乙醇浸过的无棉纸巾擦拭玻璃板,确保无灰尘颗粒粘在玻璃板表面。
2.对齐两块玻璃板,在两边放入 1.0mm 或 1.5 mm 隔板。 3.用不脱色的记号笔标记玻璃板距上沿 0.5 cm 处,在一些系统例如 Bio-Rad ProteanII,玻璃板不等长,应确保标记距短板上沿0.5 cm。 4.用打字机或铅笔标记一小条滤纸作为凝胶的标签。将滤纸放在凝胶框的左边底部。不要用记号笔,因其会渗人凝胶。 5.将整个凝胶框放人多凝胶灌注架中,同样将其他的凝胶框排列放于灌注架上,用薄塑料片(即隔板)将各凝胶框分隔开。这些薄片通常由多凝胶灌注架提供,但也可用聚酯薄膜板切割而成。用灌注架提供的隔板填充各个空格。夹紧灌注架上前面的玻璃板以确保垫片将灌胶空间密封好。 6.灌胶之前,向灌胶的空间加水来确定所需试剂的体积,测量体积的一半用于制备低(轻溶液),另一半用于制备高(重溶液)。用表 4.6 来计算灌胶中各个成分的体积。 7.制备准确体积的轻、重丙烯酰胺溶液,过硫酸铵与 TEMED 的体积忽略不计,各加一个小的磁力搅拌子。 8.用水抽真空泵来抽去丙烯酰胺中的气体(几分钟),同时在磁力搅拌器上搅拌。 虽然并非所有研究者都进行这步抽真空,但为了更佳的重复性,建议进行此步操作。 9.当溶液在抽真空时,将一根管子连到蠕动泵,先用水检验以确保制造商所建议泵的流速。一旦流速固定,将管一端连在梯度混合器的出口,另一端连到多块凝胶灌注仪的人口。在多块凝胶灌制装置的开口端放一个夹子,打开夹子,确保梯度混合器处于关闭的状态。 10.在混合器中将小磁力搅拌子放人,将梯度混合器放在磁力搅拌器上。
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实验方法原理 | 在第一向 IEF 和 IPG 胶条平衡之后,需进行第二向 SDS-PAGE。SDS-PAGE 是基于蛋白质分子量的不同而将其分离的。这种分离系统可从多家供应商处获得,在许多蛋白质化学实验室中也普遍使用。这里介绍放置 IPG 胶条的方法以及第二向凝胶电泳条件。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1.在 100°C 加热琼脂糖封闭溶液使之熔化。每块凝胶约需 1ml 溶液。完全熔化琼脂糖要花 1Omin,最好在即将平衡 IPG 胶条时进行(方案 8)。琼脂糖熔化后,将其冷却至 40~50°C。 2.在第二向凝胶表面的平板之间用钳子定位平衡后的 IPG 凝胶条,保证塑料支持条靠着其中一块玻璃平板。在平板之间用一把薄的软塑料尺子推动 IPG 胶条,直到 IPG 底边和凝胶表面紧密接触。从 IPG 胶条一端至另一端逐渐沿玻璃平板推动胶条。为了避免 IPG 胶条被撕破,应在凝胶的塑料支持面施力使 IPG 胶条放入适当位置。 保证在平板凝胶和 IPG 胶条底边之间,以及塑料支持和玻璃平板之间没有气泡。如果有气泡,轻压 IPG 胶条的塑料支持赶走气泡。如果气泡在第二. 向凝胶上方,不要过重地压 IPG 胶条表面,那样可能会使 SDS-PAGE 凝胶上表面的孔径缩小。 3.如果需要分子量标准,将准确剂量的分子量标准(对考马斯染色来说需 200~1OOOng; 对银染来说,需 10~50ng) 和已熔化的琼脂糖封闭溶液混合,吸取 15~20ul 此混合物至一小张滤纸上。 4.琼脂糖凝固后,将滤纸夹在两个玻璃平板之间,以便它在 IPG 胶条末端和平板凝胶上部相连接。 如果凝胶将用于印迹,用抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶或抗生物素蛋白-碱性磷酸酶作蛋白质检测,可使用生物素酰化标准。所使用的生物素酰化标准量见操作指导手册。 5.缓慢吸取溶化的琼脂糖封闭溶液至 IPG 胶条上,避免产生气泡。在继续下述步骤之前,琼脂糖应冷却并凝固至少 lmin。 在琼脂糖内包埋凝胶条是为了固定胶条使之处于正确位置,确保 IPG 胶条和凝胶之间的良好连接。 6.按操作指导手册,完成电泳装置的安装。连接冷却装置(如果有的话),使其保持凝胶温度在 10~15°C。 虽然冷却不是必需的,但这样可大大减少凝胶之间的变化,并允许凝胶在高电流下电泳,这样可减少电泳的时间。 建议标准和大型凝胶应冷却,冷却可大大提高凝胶之间的重复性,有助于减少人为的影响,例如凝胶的「微笑,,条带。如果在实验室中温度有大的波动,冷却就非常重要了。 7.按方案中表 7 或表 4.8 中建议的电泳条件来设置电泳仪,打开电源,开始电泳。 电泳分两步进行。第一步持续时间较短,使用低电流或低功率设置,使蛋白产生最初的迁移和堆积,在电泳开始 5~15 min 之后(见表 4.7 和表 4.8),检查溴酚蓝是否已进人凝胶;第二步,电流或功率要升高以允许快速分离。 8.当溴酚蓝达到距凝胶底部 0.5~1cm 时,关掉电源,从电泳槽中将凝胶移出。 9.将凝胶水平放置,除去隔板,小心不要损坏凝胶,用塑料弹性刀片小心将每块凝胶的两块玻璃平板分开。不要用金属切片,因其会在玻璃板上留下划痕。凝胶应该贴于其中一面玻璃板。 10.立即进行凝胶的染色(方案 10~方案 14) 或蛋白质的转膜(方案 15~16 。
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实验方法原理 | 此方案是在对 Neuhoff 等的方法进行修订的基础上建立的(1988),包括考马斯亮蓝 G250 和蛋白质的结合。考马斯亮蓝 G250 可以结合碱性氨基酸如精氨酸、酪氨酸、赖氨酸和组氨酸,染料的胶体特性使产生的背景非常低。这一特性可以阻止考马斯亮蓝渗透凝胶,避免考马斯亮蓝 R250 染色时较长的脱色过程。胶体考马斯亮蓝通常用于染色凝胶,检测范围为 8~50ng。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1.将凝胶置于玻璃或塑料培养皿中固定,轻轻摇动至少 1h。 可将凝胶固定过夜。如果凝胶有标记,多个凝胶可在同一培养皿中固定,固定液的体积应足够大,以使所有凝胶都能自由移动。 2.移走固定液,在摇床上用水清洗凝胶 10 min。 3.弃去水,重复洗 2 次。 4.在洗第三次时,将 4 份考马斯亮蓝储备液和 1 份甲醇混合,以制备胶体考马斯亮蓝染液。 5.将凝胶放在 100~300 ml 胶体考马斯染料内(染料的体积依胶的大小而定,确保染料覆盖凝胶)。在往复式或定轨式摇床上,轻摇过夜。 凝胶应在染料中放置足够长时间,其颜色会持续加深一直到第七天。 6.去除残留染料,将凝胶转移至盛有 45~55°C 双蒸水或去离子水的干净平皿中。 当水变色时弃去,再次用新的 45~55℃的 H2O 轻轻摇晃清洗凝胶。重复几次,直到蛋白质带较凝胶背景变得明显,蛋白质将在清晰的背景上出现蓝色。 7.凝胶可用于扫描分析。扫描湿凝胶较好,因为若凝胶干燥易破裂,导致数据的丢失。 8.在干燥之前,将凝胶浸在 5% 甘油中 30 min,凝胶也可装在密封塑料袋内,储存于 4°C。
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实验方法原理 |
银染聚丙烯酰胺凝胶首先由 Switzer 等引进(1979),已迅速成为一种最普遍使用的高灵敏度蛋白质染色方法。因存在背景高、重复性不好及银镜等问题,多年来对此方法的改进较多。目前,Rabilloud 等(1994b)在文献中发现 100 多种不同的方案,但所有这些方案都包含下列基本步骤:①固定;②敏化;③银液注入;④图像显色;⑤终止反应和图像固定。 我们发现银氨染色方法可提供高灵敏度,其检测范围低至 2?4ng,处理低于 Imm 厚的凝胶时效果很好。对于不同来源的干扰,银氨染色是非常敏感的,因此操作过程必须非常洁净。水和试剂的质量较关键。对所有溶液,必须用电阻率大于 15mho/cm 的去离子水。不能用双蒸水,因其会导致不稳定结果。所有化学物质应该用尽可能高的级别。凝胶在聚合作用过程中,通过加入硫代硫酸盐可使银染结果的背景水平大大降低(Hochstrasser and Merril,1988)。
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仪器、耗材 | |
实验步骤 |
多块凝胶的固定和染色应在分离的平皿中进行。 2.将水从平皿中排尽,在培养皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。勿用戴手套的手和凝胶直接接触。在平皿中倒人足够的固定液 1 以覆盖凝胶,在摇床上摇动 30~60 min。 3.制备新鲜的固定液 2, 将固定液 1 从平皿中排尽,用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。将足够的固定液 2 倒入平皿中覆盖凝胶。如果要在一天内完成银染,放在摇床上摇 2 h,否则,在平皿上盖一张塑料纸,在摇床上摇过夜。 如果凝胶摇动过夜,要确保在每个平皿中有足够溶液,避免凝胶干燥。 4.将固定液 2 从平皿中排尽。在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。 加足够的水来覆盖凝胶,在摇床上摇动 5 min。 5.每一标准尺寸的凝胶(160 mm X 20 mm X l.5 mm) 需制备 250 ml 戊二醒敏化溶液,现用现配,保证最小必需体积,迸行以下步骤 (1) 或 (2)。 (1)保证凝胶正面朝上置于平皿中,将水从平皿中排尽,小心倾倒 250 ml 戊二醛溶液,在摇床上摇动凝胶 30 min,速度要足以使平皿中的凝胶活动自如,但不要使其从溶液中滑出。 在染色过程中知道凝胶的方位将有助于「阅读分析凝胶」。一般来说,凝胶左边是酸性末端,右边是碱性末端。虽然这不能增强凝胶的染色效果,但有助于确定在反应中的凝胶上蛋白质的位置。 (2)加 200 ml 戊二醛溶液至干净的干燥平皿中,仔细将凝胶从水中转移到戊二醛溶液中。转移凝胶时要小心,因其很易碎,应从它的一个角开始以避免在凝胶上的外来压力。在摇床上摇动 30 min。使速度足以移动平皿中的凝胶,但不要使其从溶液中滑出。 6.将戊二醛溶液排入适合的废物缸中。用水洗凝胶,将水排入盛有戊二醛的废物缸中。 7.用 H2O 将凝胶覆盖,在摇床上摇 5 min。, 8.将水排尽,重复水洗 2 次。 如果需要,洗涤次数可超过 3 次,但不能少于 2 次。 9.重复步骤⑦和⑧,将每次洗涤时间延长 30 min。 如果是 5 min 的洗涤,按实验要求,可将洗涤次数升高,超过 3 次,但不要少于 2 次。 10.在步骤11之前 30?60 min 制备银染溶液。 1L 银染溶液足够染 4 块标准尺寸凝胶。 11.从平皿中将水倒出,在平皿中用一张方形塑料纸或聚碳酸酷薄片支持凝胶,将 250 ml 银染液倒入每个平皿中。在摇床上摇动 20 min。如果必要,摇动时间可缩短 15 min,但应至少 15 min,或不超过 20 min。 12.将银染溶液倒人合适的废物缸中,确保不用戴手套的手接触凝胶。 13.用足够的水快速清洗凝胶并覆盖凝胶。将水倒人盛有硝酸银的废物缸中。 14.加足够的水来覆盖凝胶,在摇床上摇动几分钟。 15.排尽水,重复水洗这一步 2 次以上。 16.凝胶在洗涤过程中时,制备显色和终止溶液,将终止溶液倒入干净的干燥的平皿中。将平皿放在易于操作的位置以避免显色和终止之间的任何延迟。H? 将水从平皿中倒掉,在平皿中用一张方形塑料纸或聚碳酸酯薄片来支持凝胶。 在平皿中加 250 ml 显色液,在放有白纸的摇床上摇动凝胶。 白纸可增强染色的蛋白质点和背景的对比度,且有助于控制终止反应的时间点。
17.当凝胶出现有效显色时,小心抬起凝胶底边快速转移到终止溶液平皿中,轻摇 1Omin。 18.弃去终止液,用 H2O 将凝胶覆盖,将凝胶放在摇床上直至其被扫描。 凝胶应尽快被扫描。来自终止液的胶中残余酸会引起蛋白质点随时间变弱。为得到准确结果,应在胶转移到水中 30 min 内扫描。
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实验方法原理 |
在方案 11 中介绍的银氨方法是用于检测在 SDS-PAGE 凝胶上蛋白质的最灵敏的方法之一。但是,这种方法和其他标准银染方法都不适合于质谱分析,而质谱已成为鉴定双向凝胶上蛋白质的最好方法。因为在凝胶中被质谱分析的蛋白质不能被修饰,许多通常用的敏化试剂(例如戊二醛和强氧化剂)不能使用。而且,研究者发现购买专用试剂盒有很多优点,因为其中的试剂质量对完成银染是有保证的。这样的试剂盒可从不同公司购得,如 Amersham Biosciences、Bio-Rad、Piece 等化学试剂供应公司。此处介绍的方法是基于 Yan 等描述的 Amersham Biosciences Plus One 银染试剂盒 (2000b)。他们发现这个方法适合 MALDI 和 ESI-MS 质谱,与其他银染方法(包括方案 11 中叙述的方法)相比,此法可处理少量制备样品且没有负染色效果。但是,这个过程与标准银染法相比灵敏度不够高。与 MS 兼容的银染方法,见 Shevchenko 等(1996)、Scheler 等(1998)、Gharahdagh 等(1999) 和 Sinha 等(2001)。
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
2.从平皿中排尽固定液,用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。不允许戴手套的手直接和凝胶接触。再加 250 ml 固定液,继续摇 15 min。 3.弃去固定液,在平皿中再次加人 250 ml 敏化液,在往复式或定轨式摇床上摇动 30 min。 4.从培养皿中排尽固定液,在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶,加足够董的去离子水来覆盖凝胶。在摇床上摇动凝胶 5 mm。 5.排尽水,重复水洗 2 次以上。 6.在步骤⑦之前 30?60 min 制备银染溶液。 对 4 个标准大小的凝胶,IL 银染溶液是足够的。 7.排尽平皿里的水,支持凝胶在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸醋薄片。在每个平皿中加 250 ml 银氨溶液在往复式或定轨式摇床上摇 20 min,摇动时间可缩短至 15 min。如有必要,应至少 15 min,不超过 20 min。 8.将银氨染色溶液倒人一个合适的废物缸中,确保不用戴手套的手接触凝胶。 9.加足够的水来覆盖凝胶。在摇床上摇 5 min。 10.排尽水,将第一次洗液倒入盛有硝酸银的废物缸。重复用 H2O 洗 2 次以上。 11.当洗凝胶时,制备显色液和终止液。将终止液放在易操作的位置以避免显色和终止之间的延迟。 12.从平皿中排尽水,在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。在培养皿中加 250 ml 反应液。在放有白纸的摇床上摇动。 白纸可提高被染色蛋白和背景之间的反差,提高决定反应终止点的准确度。
13.当凝胶充分显色后,将显『色液倒人合适的废物缸内。在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶,快速将 250 ml 终止溶液倒人平皿中,在摇床上摇动 IOmin0 14.弃去终止液,用 H2O 覆盖凝胶,在摇床上摇动 5 min。 15.倒掉水,重复水洗 2 次以上,准备对凝胶进行扫描分析或质谱分析。
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实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1.将胶放入聚丙烯塑料平皿中,其中应有足够的固定溶液,使凝胶在平皿中能自由漂浮。在摇床上摇动 30 min。 如果是多块凝胶同时被固定,应在不同的平皿中染色。 2.从平皿中倒出固定液,在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。不要用带手套的手接触凝胶。将凝胶放在 SYPRORuby 溶液中染色 90 min,放置^往复式或定轨式摇床,黑暗中温育过夜。 标准大小的凝胶所需染色液的最小体积如下: 如染色液太少,会降低敏感度。伴随染色时间的延长,敏感度会升高。染色少于 3 h 可获得最大敏感度。如果继续染色,将会大大降低敏感度。 3.(可选)弃去 SYPRORuby 染色液。如有残留染料会导致较高的荧光背景。 为了将残留染料除去,将凝胶放在一定体积的固定液中(体积相当于步骤②中染料体积),在摇床上摇动 30 min。 4.用 300nm 蓝光透射仪或激光扫描仪呈现蛋白。SYPRORuby 的最大激发波长是 300nm 和 420nm,最大发射波长是 618nm。 一些预制凝胶的聚酯化背面对荧光是高度敏感的,此时应用 UV 透射仪。将聚丙烯酰胺凝胶颠倒,用一个发射过滤器来屏蔽蓝色荧光。蓝光透射仪或激光扫描仪的使用将会减少塑料背面的荧光数量。这种染料和目胃系统相适合。图像系统在 450nm、473nm、488nm、532nm 都有激光发射。目前,激光扫描仪的最大供应商也能提供选择过滤这种染料的装置。
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实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1.将凝胶放入盛有 50 ml 水的平皿中,在往复式或定轨式摇床上摇动凝胶 1Omin。 2.将凝胶转移到盛有 25 ml 磺基水杨酸溶液的平皿中,摇动 15 mm。 3.再将凝胶放在 25 ml 含氯化钙的磺基水杨酸溶液中,在摇床上摇动 30 min。 4.迅速用清水洗涤凝胶表面以去除连接在其上的氯化钙。 5.将凝胶转移到 25 ml 0.5mol/L NaOH,用盖子将平皿盖上,在 65°C 下保温 20 min。 6.再将凝胶放入 25 ml 钼酸铵溶液中,在摇床上摇动 lOmin。 7.重复步骤6。 8.将凝股转移到 25 ml 含硝酸的钼酸铵溶液中,在摇床上摇动 20 min。 9.将凝胶放人甲基绿溶液中,在摇床上摇动 20 min。 10.进行脱色,将凝胶转移到 25 ml 硫代硫酸钠溶液,在摇床上摇动 15 min。 11.重复步骤10,此时可以看见磷酸化蛋白的绿色点。 12.为了使凝胶完全脱色,将其放人 25 ml 的 7% 乙酸中,在摇床上摇动过夜。在脱色期间,当溶液变绿时,换一次乙酸溶液。 13.在磷酸化蛋白呈现颜色之后,用考马斯亮蓝染凝胶上的总蛋白。
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实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1.测量 SDS-PAGE 凝胶的尺寸,将转移膜剪成与凝胶相适应的尺寸。 槽式转移系统的膜根据需要可以剪成比凝胶大或者小。 2.用水将薄膜润湿或用甲醇将 PVDF 膜润湿。操作要小心,以避免膜不平整及膜下面产生气泡。 3.将湿润的薄膜转移到一个盛有转移缓冲液的平皿中,使膜在其中平衡 5 min。 4.将印迹纸剪切成合适大小,按照转移设备的指导手册进行操作。 5.将印迹纸、凝胶和膜排列成「三明治」状,避免在任何层之间产生气泡。这是很关键的,因为气泡可阻止相关位置蛋白质的转移。最好按以下(1)~(8)的说明进行操作: (1)将转移盒放人盛有转移缓冲液的平皿中。 (2)将泡沫海绵放在转移盒里,挤压走所有气泡。 (3)将印迹纸的一层放在海绵的上面,以保证其完全湿润和平整;在印迹纸上来回滚动玻璃棒以赶走气泡。 (4)将双向凝胶放在印迹纸表面,排列整齐,通过滚动的玻璃棒赶走所有的气泡,但要小心不要在凝胶上施加太多的压力。 (5)将转移膜放在凝胶上方,注意一开始应将膜放在准确的位置,在凝胶上移动膜通可能引起污迹;用滚动的玻璃棒去除膜与凝胶之间的气泡。 (6)将另外一张印迹纸放在膜上,确保它湿润、平整;通过滚动玻璃棒去除印迹纸表面的气泡。 (7)将泡沫海绵放在转移盒中,挤压走海绵中的气泡。 (8)盖上转移盒的盖子。 6.对其他每块要进行电泳转移的凝胶重复步骤5。 7.在转移盒中装人 2/3 体积的转移缓冲液。 8.将转移盒放入转移槽中。
9.在转移单元中加转移缓冲液以确保所有的转移盒浸没在缓冲液中。 10.将盖子放在转移槽上,使正极(红)接近于膜而不是凝胶。 使在电泳期间,使凝胶上的蛋白质从负极(黑)迁移到正极(红)。 11.如果转移进行 lh,将循环水浴和热交换系统相连,温度设置在 15°C。 这种转移设备在高电流条件下使用,如没有有效的冷却设备,将会损坏转移设备。循环水浴将能保持转移过程中的温度。 12.按照操作指导手册建议的时间和电流进行转移。 13.当完成转移时,停止水浴,关掉电源。打开盖子,移出转移盒。 14.卸下转移盒里的海绵、印迹纸、膜、凝胶。用去离子水洗净海绵,在空气中瞭干以备下一次使用。用软铅笔来标记对着凝胶的膜面的一边。 不要用钢笔或记号笔,因为墨水会溶解在浸膜所用的缓冲液中。 15.对膜进行染色或处理印迹(参见方案 17~20),或将膜置于印迹纸之间,于黑暗处干燥保存。 如果干燥保存,在染色之前,必须用水(硝酸纤维素薄膜)或甲醇 (PVDF 膜)重新湿润。
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实验方法原理 | 当 “ 三明治”结构中的滤纸浸透缓冲液时,半干印迹转移设备能将蛋白质从凝胶转移到膜上。和槽式印迹转移设备相比,半干印迹只用较少的缓冲液;因为电极板靠得很近,故转移时只要求较低的电压。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1.测量 SDS-PAGE 凝胶的尺寸,将转移膜与 6 层印迹纸剪切成与凝胶同样大小。 2.用水湿润膜或用甲醇湿润 PVDF 膜,缓慢操作,以避免膜不平整或在膜下产生气泡。 3.将湿润的膜转移到盛有转移缓冲液的平皿中,让其在缓冲液中平衡 5 min。 4.将印迹纸、膜与凝胶排列成「三明治」状,要避免产生气泡,因为气泡会阻止蛋白质的转移。最好按照以下方法操作: (1)印迹纸和 B 吴要用转移缓冲液湿润,滚动玻璃棒来赶走气泡。 (2)将转移膜放在印迹纸表面。 (3)将凝胶放在膜上,注意一开始应将凝胶放在准确的位置,在膜上移动凝胶通常可能引起污迹;滚动玻璃棒除去膜与凝胶之间的气泡。 (4)再用缓冲液湿润三层印迹纸,将其放在凝胶上,滚动玻璃棒以赶走气泡。 (5)将电极连接好。 在电泳期间,蛋白质将从负极(黑色)迁移到正极(红色)。 5.按照操作说明所建议的时间与电流进行转膜。 6.转膜完成后,关掉电源,去掉盖子。 7.取出转移膜,去掉印迹纸,用软铅笔标记膜对着凝胶的一面。 不能用钢笔或记号笔,因为墨水会溶解在膜的转移缓冲液中。 8.对印迹膜进行染色处理(参见方案 17~20),或将膜干燥保存在两层印迹纸之间,置于暗处。 保存的膜在染色前,应用水重新湿润硝酸纤维素薄膜或用甲醇湿润 PVDF 膜。 |
实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
实验步骤 | 1.用丽春红 S 染液浸没转移后的膜,轻摇 5 min。 2.弃去染液,用水清洗膜,重复几次,直到蛋白质条带变得清晰。 不要重复使用染料,因为这可能使结果重复性变差。第一次用完后,将染料尽量排尽。 3.用一只软铅笔标记主要蛋白质条带和标准分子量蛋白质条带。 4.继续用水清洗膜,轻摇直到将丽春红 S 染液完全除去。 5.对膜上的蛋白质条带进行分析或保存。 |
实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
实验步骤 | 1.将转移后的膜浸在考马斯亮蓝染液中,轻摇 5min 。 2.弃去染液,在摇床上用含乙酸的甲醇进行脱色。不要重复使用染液,因为这样会使结果的重复性变差。 3. 用水洗膜,轻摇 5min。 |
实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
实验步骤 | 1.将膜浸人吐温-20 溶液中,轻摇 10 min。 2.弃去吐温-20 溶液。 3.重复步骤1与2三次。 4.将膜转人印度墨水中,轻摇染色 2~18 h。 5.弃去染液,用吐温-20 溶液洗膜,轻摇 5 min。 |
实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
实验步骤 | 1.将膜浸入吐温-20 溶液中,37°C,轻摇 45 min。 2.室温下,用吐温-20 溶液洗膜,轻摇 5 min。 3.弃去洗液,多次重复步骤①和②。 4.室温下在胶体金染液中染膜 2 h,轻摇。 5.用水洗膜,轻摇 5 min。 |
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