构建Kmt2c/d条件敲除小鼠模型
研究尿路上皮Kmt2c/d缺失对组织学和分子表型的影响。
利用Tmprss2-CreERT2和Kmt2cf/f;Kmt2df/f小鼠，通过他莫昔芬诱导尿路上皮特异性基因敲除，并进行长期观察和组织学分析。
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Kmt2c或Kmt2d缺失使尿路上皮为肿瘤发生做好准备，并将KMT2A-menin重新分布到二价启动子
Loss of Kmt2c or Kmt2d primes urothelium for tumorigenesis and redistributes KMT2A-menin to bivalent promoters
实验完整度
高包含基因工程小鼠模型、类器官培养、scRNA-seq、ChIP-seq/Cut&Run、PRO-cap等独立实验层级，并进行功能验证（类器官形成、侵袭）和机制验证（表观遗传重编程）。
主要模型
Tmprss2-CreERT2;Kmt2cf/f;Kmt2df/f基因工程小鼠 小鼠尿路上皮类器官 NOD-SCID小鼠乳腺脂肪垫移植瘤模型
重点核对
Kmt2c/d基因敲除效率及H3K4me1水平 scRNA-seq细胞分群和差异基因分析条件 BBN诱导膀胱癌模型处理方案（0.05% BBN，12周） MI-503处理浓度和持续时间（1µM，4天） EGFR抑制剂给药方案（afatinib 10mg/kg/天）
摘要
KMT2C/D–KDM6A复合物的成员在尿路上皮癌和组织学正常的尿路上皮中频繁突变。在这里，我们使用基因工程小鼠模型证明，尿路上皮中Kmt2c/d敲除导致分化受损、对生长和炎症刺激的反应增强，以及对致癌物和癌基因的致癌转化敏感。机制上，KMT2D定位于活性增强子和CpG贫乏的启动子，这些启动子优先调控尿路上皮谱系程序，而Kmt2c/d敲除导致这些位点的H3K4me1、H3K27ac和新生成RNA转录减少，从而导致分化受损。Kmt2c/d敲除进一步导致KMT2A–menin从KMT2D定位的增强子重新分布到富含CpG和二价的启动子，导致信号诱导的即早基因去抑制。治疗上，Kmt2c/d敲除上调表皮生长因子受体信号，并赋予对表皮生长因子受体抑制剂的敏感性。总之，我们的数据表明，Kmt2c/d的功能丧失许可了一种分子“场效应”，使组织学正常的尿路上皮为致癌转化做好准备，并呈现出治疗脆弱性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Kmt2c/d功能缺失如何促进尿路上皮肿瘤发生，并影响表观遗传和基因表达？
- 核心机制
- Kmt2c/d缺失导致KMT2D定位的增强子和CpG贫乏启动子上H3K4me1、H3K27ac和新生RNA减少，同时KMT2A-menin重新分布到CpG高、二价的启动子，导致即早基因和炎症基因去抑制，从而引发致癌转化。
- 主要证据
- 利用基因工程小鼠和类器官模型，结合scRNA-seq、ChIP-seq/Cut&Run、PRO-cap和功能实验，证明Kmt2c/d缺失诱导分化受损、促进干细胞特性和EMT，并增强对致癌物和致癌基因的敏感性。
- 研究意义
- 研究表明Kmt2c/d缺失构成分子“场效应”，使组织学正常的尿路上皮为致癌转化做好准备，并提示EGFR抑制剂作为治疗策略的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组分析尿路上皮细胞状态
揭示Kmt2c/d缺失对尿路上皮细胞分化和功能状态的全局影响。
对FACS分选的尿路上皮细胞进行scRNA-seq，并进行聚类、差异表达和基因集富集分析。
体外类器官和细胞功能验证
验证Kmt2c/d缺失对尿路上皮细胞干性、分化和侵袭能力的影响。
培养尿路上皮类器官，进行形成效率、分化诱导、transwell侵袭实验和免疫荧光染色。
表观遗传重编程分析
阐明Kmt2c/d缺失导致的染色质状态和组蛋白修饰变化。
使用ChIP-seq/Cut&Run、ATAC-seq、PRO-cap和质谱分析组蛋白修饰和KMT2复合物分布。
Kmt2c/d缺失对肿瘤发生的协同作用
评估Kmt2c/d缺失是否增强致癌物和致癌基因诱导的肿瘤发生。
将Kmt2c/d KO与Pten缺失、BBN处理或致癌基因过表达结合，观察肿瘤形成。
治疗靶点验证
评估Kmt2c/d缺失是否导致对EGFR抑制剂的敏感性。
用EGFR抑制剂（afatinib、gefitinib）处理WT和dKO细胞，并观察体内肿瘤对afatinib的反应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因敲除诱导 | 他莫昔芬 | Toronto Research Chemicals | T006000 |
| 4-羟基他莫昔芬 | Millipore Sigma | H7904 | |
| 细胞培养 | 高级DMEM/F12培养基 | Gibco | 12634010 |
| B27添加剂 | Gibco | 17504044 | |
| 表皮生长因子 | PeproTech | AF-100-15 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | |
| A83-01 | Selleckchem | S7692 | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Millipore Sigma | A9165 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030081 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| 基质胶 | BD | 356231 | |
| I型胶原蛋白 | Gibco | A1048301 | |
| 细胞处理 | MI-503 | Selleckchem | S7817 |
| 阿法替尼 | MedChemExpress | HY-10261 | |
| 吉非替尼 | -- | -- | |
| 细胞分离 | 胶原酶/透明质酸酶 | Stemcell Technologies | 07912 |
| TrypLE消化液 | Gibco | 12605010 | |
| 流式分析 | DAPI | -- | -- |
| 流式分选 | 抗EpCAM抗体 | eBioscience | 17579180 |
| 单细胞测序 | Chromium单细胞3' GEM、文库和凝胶珠试剂盒v3 | 10X Genomics | -- |
| 免疫荧光 | 分散酶 | Gibco | 17105041 |
| 免疫染色 | 抗KRT5抗体 | Biolegend | 905501 |
| 抗KRT8抗体 | Biolegend | 904801 | |
| 抗KRT14抗体 | Biolegend | 906004 | |
| 抗UPK2抗体 | Abcam | ab213655 | |
| 抗GFP抗体 | Cell Signaling Technology | 2956 | |
| 抗Ki-67抗体 | Abcam | ab16667 | |
| 抗PTEN抗体 | Cell Signaling Technology | 9188 | |
| 抗SMA抗体 | Abcam | ab5694 | |
| 抗p-EGFR (Tyr845)抗体 | Cell Signaling Technology | 2231 | |
| 抗H3K4me1抗体 | Cell Signaling Technology | 5326 | |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| 抗p-AKT (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗p-AKT (Thr308)抗体 | Cell Signaling Technology | 13038 | |
| 抗p-ERK (Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗KMT2A抗体 | Cell Signaling Technology | 14689 | |
| 抗KMT2B抗体 | Cell Signaling Technology | 47097 | |
| 抗menin抗体 | Bethyl Laboratories | A300-115A | |
| 抗SET1A抗体 | Cell Signaling Technology | 50805 | |
| 抗SET1B抗体 | Cell Signaling Technology | 44922 | |
| 抗CXXC1抗体 | Abcam | ab198977 | |
| 抗PIK3CA抗体 | Cell Signaling Technology | 4249 | |
| 抗RAS抗体 | Cell Signaling Technology | 8832 | |
| 抗p53抗体 | Cell Signaling Technology | 2524 | |
| 抗Vinculin抗体 | Cell Signaling Technology | 13901 | |
| RIPA裂解液 | -- | -- | |
| ECL蛋白质印迹底物 | Thermo Fisher Scientific | 32106 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| High-Capacity cDNA反转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | A25741 | |
| 总RNA提取试剂盒 | Omega Bio-Tek | R1034 | |
| CRISPR | LentiCRISPRv2载体 | Addgene | 98293 |
| Surveyor检测 | New England Biolabs | M0302 | |
| 生化检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 组织学 | OCT包埋剂 | -- | -- |
| 分散酶 | Gibco | 17105041 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 质谱 | TSQ Quantum Ultra质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| UltiMate 3000 Dionex纳升液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- | |
| 测序平台 | NovaSeq测序平台 | Illumina | -- |
| HiSeq4000测序仪 | Illumina | -- | |
| NovaSeq6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 细胞分选 | BD FACSymphony S6细胞分选仪 | BD | -- |
| 流式分析 | BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD | -- |
| 显微成像 | Nikon ECLIPSE Ti2倒置显微镜 | Nikon | -- |
| Leica TCS SP5正置共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| Mirax数字切片扫描仪 | Zeiss | -- | |
| 动物成像 | IVIS Spectrum活体成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 蛋白质印迹成像 | Amersham ImageQuant 800成像仪 | Cytiva | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因敲除诱导 | 他莫昔芬剂量和给药方式：3mg ×2次，腹腔注射，间隔48小时；4OHT浓度：0.2µM处理24小时 阅读提示：Methods: Mouse studies |
| 单细胞RNA测序 | 样本数：WT n=4，dKO n=3；处理时间：他莫昔芬后3个月；细胞分选标记：EpCAM+/nlsEGFP+ 阅读提示：Methods: ScRNA-seq and analysis |
| 类器官培养 | 培养基配方、Matrigel比例、EGF浓度（50ng/ml）、Y-27632、A83-01等 阅读提示：Methods: Urothelial cell culture and characterization |
| 侵袭实验 | Matrigel预包被浓度（1:30稀释）、细胞数量（100,000）、饥饿时间（48小时） 阅读提示：Methods: Urothelial cell culture and characterization |
| 表观遗传分析 | 抗体信息、细胞数量、测序平台、数据处理参数 阅读提示：Methods: Epigenetic sequencing |
| BBN诱导肿瘤 | BBN浓度（0.05%）、处理时长（12周）、观察时间（4周后） 阅读提示：Methods: Mouse studies |
| 体内治疗实验 | 细胞移植数量（2百万）、给药方案（afatinib 10mg/kg/天，口服灌胃）、肿瘤测量频率 阅读提示：Methods: Mouse studies |