鉴定RelA和Rel的全基因组结合位点
确定RelA和Rel在BCR激活的B细胞中不同时间点的基因组结合模式。
使用抗RelA和抗Rel抗体进行ChIP-seq，在anti-IgM激活0、1、4、18小时后分析结合位点。
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NF-κB亚基在抗原受体激活的B细胞中指导动力学上不同的转录级联反应
NF-κB subunits direct kinetically distinct transcriptional cascades in antigen receptor-activated B cells
实验完整度
高包含ChIP-seq、ATAC-seq、bulk RNA-seq和scRNA-seq等多组学分析，以及RelA和Rel敲除小鼠模型的功能验证，多层次证据支持结论。
主要模型
小鼠原代脾脏B细胞 RelA条件敲除小鼠（RelAfl/flxCd19-cre） Rel敲除小鼠（Rel−/−） 滤泡B细胞和边缘区B细胞
重点核对
BCR激活时间点：0、1、4、18小时 使用anti-IgM Fab'2进行BCR交联，浓度10 μg/ml 使用BAY 11-7082（1 μM）抑制IKK2 细胞培养密度：2 × 10^6 cells/ml RelA和Rel ChIP-seq抗体特异性验证
摘要
核因子κB（NF-κB）转录因子家族在多种细胞类型中协调信号诱导的基因表达。细胞对NF-κB激活的反应在细胞和信号特异性以及家族成员差异使用（亚基特异性）的水平上受到调控。在这里，我们利用时间依赖性多组学研究Rel和RelA（两种密切相关的NF-κB蛋白）在通过B细胞受体激活的原代B淋巴细胞中的选择性功能。尽管在全基因组范围内存在大量共享结合位点，Rel和RelA在激活的B细胞中指导了动力学上不同的基因表达级联。单细胞RNA测序揭示了Rel和RelA特异性反应的显著异质性，而这两个因子的顺序结合并非延长转录的主要机制。此外，Rel和RelA的核共表达导致了两个因子之间的功能性拮抗作用。通过严格鉴定每个NF-κB亚基的靶基因，这些研究为Rel和RelA在免疫和癌症中的独特功能提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RelA和Rel这两个密切相关的NF-κB家族成员如何在抗原受体激活的B细胞中实现亚基特异性的基因表达调控？
- 核心机制
- RelA和Rel在激活后不同时间点结合基因组，分别指导早期和晚期的基因表达级联；核内RelA和Rel共表达时，Rel可能通过与RelA竞争结合位点或作为较弱的转录激活因子，从而拮抗RelA依赖的基因表达。
- 主要证据
- 通过ChIP-seq鉴定RelA和Rel的全基因组结合位点，结合ATAC-seq和组蛋白修饰分析染色质状态，利用bulk RNA-seq和scRNA-seq分析基因表达动态，并在RelA或Rel敲除B细胞中验证靶基因依赖性。
- 研究意义
- 该研究定义了NF-κB亚基特异性的靶基因，揭示了Rel和RelA在免疫和癌症中的独特功能，为理解NF-κB在生发中心反应和B细胞淋巴瘤中的作用提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析染色质可及性和组蛋白修饰
探究RelA和Rel结合区域的表观遗传特征及其在激活过程中的动态变化。
使用ATAC-seq和针对H3K27ac、H3K4me1和H3K4me3的ChIP-seq，分析相同时间点的染色质状态。
分析BCR激活后的转录组变化
描绘BCR激活后基因表达的动态变化，并识别受NF-κB调控的基因。
使用bulk RNA-seq分析WT、BAY处理、RelA cKO和Rel KO B细胞在0、1、4、18小时的基因表达。
单细胞水平分析NF-κB靶基因表达
在单细胞分辨率下验证RelA和Rel靶基因的表达异质性。
使用10x Genomics Chromium平台进行scRNA-seq，分析WT、RelA cKO和Rel KO B细胞在不同时间点的基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | HyClone | SH30088.03 | |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺 | Invitrogen | 10378016 | |
| B细胞活化因子 | R&D Systems | 2149-BF | |
| BCR激活 | 山羊抗小鼠IgM Fab'2 | Jackson Laboratory | 115-006-075 |
| 药物处理 | BAY 11-7082 | Calbiochem | B5556 |
| 细胞分选 | EasySep小鼠B细胞分离试剂盒 | Stemcell Technologies | 19854 |
| RoboSep缓冲液 | Stemcell Technologies | 20104 | |
| 流式分析 | 抗RelA抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-372 |
| 抗Rel抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-71 | |
| Western blot | 抗hnRNP A1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32301 |
| ChIP-seq | 抗H3K27ac抗体 | Active Motif | 39133 |
| 抗H3K4me1抗体 | Abcam | ab8895 | |
| 抗H3K4me3抗体 | Abcam | ab8580 | |
| Western blot | 辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 |
| 辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| 增强化学发光系统 | Pierce Biotechnology | 32106 | |
| Syngene成像系统 | -- | -- | |
| 流式分析 | 抗RelA抗体 | Cell Signaling Technology | 8242S |
| 同型对照抗体 | Cell Signaling Technology | 3900 | |
| 抗兔Fab'2-AF647抗体 | Cell Signaling Technology | 4414 | |
| Myc-AF-647抗体 | Cell Signaling Technology | 13871 | |
| Egr2-APC抗体 | eBiosciences | 17-6691-82 | |
| Rel-PE抗体 | eBiosciences | 12-6111-80 | |
| Ikba-PE抗体 | Cell Signaling Technology | 7523 | |
| Dec1-AF-594抗体 | Novus Biologicals | 1800AF594 | |
| Ezh2-PE抗体 | BD Biosciences | 562478 | |
| CD72-BV421抗体 | BD Biosciences | 740058 | |
| HSP90-β抗体 | Invitrogen | PA3-012 | |
| 抗兔Fab'2-PE抗体 | Cell Signaling Technology | 79408 | |
| 图像细胞术 | 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | P1585 |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| 核糖核酸酶A | Invitrogen | 912091021 | |
| Amnis ImageStream X Mk II成像流式细胞仪 | Luminex | -- | |
| ChIP | 乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯) | Pierce Biotechnology | 21565 |
| 甲醛 | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 蛋白A磁珠 | Invitrogen | 10001D | |
| 蛋白G磁珠 | Invitrogen | 10003D | |
| ChIP-qPCR | SYBR Green快速PCR预混液 | Applied Biosystems | 4385610 |
| ChIP-seq | NuGEN Ovation Ultralow DNA-seq文库制备试剂盒 | Tecan | 0344-32 |
| Illumina NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| ATAC-seq | FC-121-1030转座酶试剂盒 | Illumina | FC-121-1030 |
| MinElute离心柱 | Qiagen | 28004 | |
| NEB高保真2× PCR预混液 | New England Biolabs | M0541 | |
| RNA-seq | RNeasy Plus Mini试剂盒 | Qiagen | 74134 |
| RT-qPCR | SuperScript第一链合成系统 | Invitrogen | 11904018 |
| SuperScript IV VILO预混液 | Invitrogen | 11756050 | |
| ABI ViiA 7实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | 4453545 | |
| iTaq Universal SYBR Green预混液 | BioRad | 1725150 | |
| RNA-seq | Illumina TruSeq总RNA制备试剂盒 | Illumina | 20040525 |
| Illumina HiSeq 2000测序仪 | Illumina | -- | |
| SMARTer链特异性总RNA-seq试剂盒v2—Pico Input哺乳动物 | Takara Bio | 634412 | |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| scRNA-seq | Chromium单细胞3' GEM试剂盒v3 | 10x Genomics | 1000094 |
| Chromium单细胞3'凝胶微珠试剂盒v3 | 10x Genomics | 1000093 | |
| Chromium芯片B单细胞试剂盒 | 10x Genomics | 1000153 | |
| Chromium单细胞3'文库试剂盒v3 | 10x Genomics | 1000095 | |
| Chromium i7多重试剂盒 | 10x Genomics | 220103 | |
| Illumina HiSeq2500测序仪 | Illumina | -- | |
| Agilent高灵敏度DNA试剂盒 | Agilent | 5067-4626 | |
| 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| 细胞处理 | TAT-Cre重组酶 | Excellgen | EG-1001 |
| 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| 细胞分选 | BD FACS-Aria Fusion流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 抗B220抗体 | BioLegend | 103240 | |
| 抗AA4.1抗体 | BioLegend | 136510 | |
| 抗CD21抗体 | BioLegend | 123410 | |
| 抗CD23抗体 | BioLegend | 101606 | |
| 流式分析 | BD Symphony流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| FlowJo v10.1软件 | -- | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9.2软件 | -- | -- |
| 数据处理 | Cell Ranger (v.3.0.2)软件 | 10x Genomics | -- |
| Seurat v3.2.3软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与激活 | 小鼠品系、年龄、性别；B细胞分离方法；anti-IgM浓度及激活时间；细胞培养密度 阅读提示：Methods部分：Mice, B cell preparation, cell culture and antibodies |
| 药物处理 | BAY 11-7082浓度、预处理时间 阅读提示：Methods部分：Mice, B cell preparation, cell culture and antibodies |
| ChIP-seq | 抗体类型及用量、交联条件、染色质片段化大小、测序平台 阅读提示：Methods部分：ChIP and ChIP–seq library construction |
| ATAC-seq | 细胞数量、转座酶用量、PCR循环数 阅读提示：Methods部分：ATAC-seq library construction |
| RNA-seq | RNA提取试剂盒、文库制备方法、测序平台 阅读提示：Methods部分：RNA isolation for quantitative RT–PCR and RNA-seq of bulk B cells and Fo/MZ cells |
| scRNA-seq | 10x Genomics试剂盒版本、上样细胞数、测序深度、质量过滤参数 阅读提示：Methods部分：Droplet-based single-cell sequencing 和 scRNA-seq data processing |