临床样本关联分析
探究FBXW7表达与RSV感染严重程度的关系
收集70例RSV感染患儿和40例健康儿童外周血，分离PBMC，Q-PCR检测FBXW7 mRNA表达，并比较轻度和中度感染组
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E3泛素连接酶FBXW7在抗病毒应答中对RIG-I稳定性至关重要
E3 ligase FBXW7 is critical for RIG-I stabilization during antiviral responses.
实验完整度
高包含临床PBMC样本、细胞系、原代巨噬细胞/DC、条件敲除小鼠模型，并有功能验证和机制验证
主要模型
RSV感染儿童及健康儿童外周血PBMC THP-1细胞 Lysm+FBXW7f/f条件敲除小鼠及腹腔巨噬细胞/BMDC/BMDM HEK293T与RAW264.7细胞系
重点核对
Lysm+FBXW7f/f小鼠以8×10^7 p.f.u. g−1尾静脉注射VSV进行生存分析，n=9每组 Lysm+FBXW7f/f小鼠以1×10^8 p.f.u. g−1腹腔注射VSV后检测肺组织病理及器官病毒载量 巨噬细胞及BMDC感染VSV(MOI=1)、H1N1(MOI=10)、RSV(MOI=10)后检测IFN-β、IFN-α4、ISG15/ISG20及病毒基因mRNA CHX(40 μg ml−1)处理后检测RIG-I和SHP2蛋白半衰期 SHP2第558和562位丝氨酸突变为甘氨酸影响FBXW7结合与SHP2降解
摘要
病毒可通过降解RIG-I或干扰RIG-I信号通路来逃避宿主识别，从而建立持续感染。然而，宿主细胞如何稳定RIG-I蛋白以避免其降解的机制在很大程度上仍不清楚。本文报道，病毒感染后，E3泛素连接酶FBXW7从细胞核转位至细胞质并稳定RIG-I。FBXW7与SHP2相互作用，介导SHP2的降解和泛素化，从而破坏介导RIG-I降解的SHP2/c-Cbl复合物。感染VSV或甲型流感病毒时，FBXW7条件性敲除小鼠（Lysm+FBXW7f/f）表现出抗病毒免疫功能受损。FBXW7缺陷的巨噬细胞中RIG-I蛋白水平和I型干扰素信号降低。此外，RSV感染儿童的PBMC中FBXW7 mRNA水平降低。我们的结果确定FBXW7是RIG-I的重要相互作用伙伴。这些发现为FBXW7在抗病毒免疫中的功能及其相关临床意义提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 宿主细胞如何稳定RIG-I蛋白以避免其降解，从而维持有效的I型干扰素抗病毒免疫？
- 核心机制
- 病毒感染后FBXW7经CRM1从细胞核转位至细胞质，与SHP2结合并介导SHP2 K48连接泛素化及降解，破坏SHP2/c-Cbl复合物，从而抑制RIG-I的K48泛素化降解并稳定RIG-I。
- 主要证据
- RSV感染儿童PBMC中FBXW7 mRNA降低；FBXW7缺陷巨噬细胞和BMDC中RIG-I蛋白、I型干扰素及下游IRF3/TBK1磷酸化降低；Lysm+FBXW7f/f小鼠对VSV和H1N1更敏感；共免疫沉淀和免疫荧光证实FBXW7-RIG-I-SHP2相互作用及SHP2降解机制。
- 研究意义
- 研究揭示了FBXW7在抗病毒固有免疫中的新功能及其与人类RSV感染的相关性，为理解RIG-I稳定性调控及抗病毒策略提供了线索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞功能验证
验证FBXW7对RNA病毒复制和I型干扰素产生的影响
在THP-1细胞中siRNA沉默FBXW7，在腹腔巨噬细胞和BMDC中检测FBXW7缺失或过表达后病毒感染下的IFN-β、IFN-α4、ISG及病毒基因表达，并以VSV-GFP感染进行流式检测
体内敲除小鼠抗病毒验证
验证FBXW7在宿主抗RNA病毒免疫中的作用
构建Lysm+FBXW7f/f条件敲除小鼠，分别以VSV尾静脉注射和H1N1滴鼻感染，观察生存率、肺组织病理、器官病毒载量及血清和器官中IFN-β、IL-6水平
RIG-I稳定性及信号通路分析
确定FBXW7是否通过保护RIG-I蛋白影响下游信号
检测FBXW7缺失巨噬细胞感染VSV后IRF3、TBK1、p65、p38、ERK磷酸化及RIG-I蛋白和mRNA水平，用CHX追踪RIG-I半衰期，免疫荧光和共免疫沉淀检测FBXW7与RIG-I相互作用
FBXW7核质转位机制验证
验证病毒感染诱导的FBXW7核输出及其对抗病毒功能的重要性
免疫荧光观察FBXW7与CRM1共定位，Western blot检测核质分离中FBXW7分布，Leptomycin B处理及FBXW7转位突变体转染后检测IFN-β和VSV-G表达及FBXW7-RIG-I相互作用
FBXW7与SHP2相互作用及SHP2降解机制
阐明FBXW7稳定RIG-I的分子机制
通过Flag免疫沉淀和质谱鉴定FBXW7相互作用蛋白，共免疫沉淀验证FBXW7与SHP2结合及结构域，构建SHP2 558A/562A突变体，检测FBXW7对SHP2蛋白半衰期、泛素化类型和K91位点的影响
SHP2介导FBXW7功能的验证
确认FBXW7稳定RIG-I和促进IFN-β产生依赖于SHP2
在SHP2f/f和Lysm+SHP2f/f巨噬细胞中检测IFN-β和VSV-G，FBXW7过表达或敲低联合SHP2敲低，共免疫沉淀检测FBXW7/RIG-I/SHP2/c-Cbl复合物，体外纯化蛋白结合实验
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
评估体内抗病毒效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| BMDM分化 | 重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子 | R&D | 416-ML |
| BMDC分化 | 重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | 315-03 |
| 小鼠IL-4 | PeproTech | 214-14 | |
| 免疫印迹/免疫沉淀 | 抗HA标签抗体 | Santa Cruz | sc-805 |
| 抗Myc标签抗体 | Santa Cruz | sc-40; sc-789 | |
| 抗Flag标签抗体 | Santa Cruz | sc-807 | |
| 免疫印迹 | 抗β-actin抗体 | Santa Cruz | sc-130619 |
| 抗泛素抗体 | Santa Cruz | sc-271289 | |
| 免疫荧光 | 抗CRM1抗体 | Santa Cruz | sc-74455 |
| 免疫印迹/免疫沉淀 | 抗SHP2抗体 | Santa Cruz | sc-280 |
| 免疫荧光 | 抗SHP2抗体 | Santa Cruz | sc-280AC |
| 免疫印迹 | 抗RIG-I抗体 | Cell Signaling Technology | D14G6 |
| 抗MDA-5抗体 | Cell Signaling Technology | 5321 | |
| 抗MAVS抗体 | Cell Signaling Technology | 4983 | |
| 抗TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3504 | |
| 抗IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4962 | |
| 抗磷酸化IRF3 (Ser396)抗体 | Cell Signaling Technology | 4947 | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9251 | |
| 抗JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| 抗磷酸化p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 抗磷酸化p38抗体 | Cell Signaling Technology | 9215 | |
| 抗p38抗体 | Cell Signaling Technology | 9212 | |
| Lys48特异性多泛素抗体 | Millipore | 05-1307 | |
| 抗FBXW7抗体 | Abcam | ab12292 | |
| 抗FBXW7抗体 | Thermo Fisher | 40-1500 | |
| 蛋白酶体抑制 | MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 |
| 免疫沉淀 | Flag-M2磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 |
| ELISA | 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | eBioscience | -- |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | eBioscience | -- | |
| IFN-β ELISA试剂盒 | PBL Biomedical Laboratories | -- | |
| 质粒转染 | JetPrime转染试剂 | Polyplus | -- |
| siRNA转染 | INTERFERin转染试剂 | Polyplus | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Takara | -- |
| 逆转录 | 逆转录酶 | Toyobo | -- |
| qPCR | SYBR Green master Rox | Roche | -- |
| 免疫沉淀 | 免疫沉淀裂解液 | Pierce | 87785 |
| 免疫沉淀/免疫印迹 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | P8340 |
| 免疫沉淀 | 蛋白G磁珠 | Pierce | 88848 |
| 免疫印迹 | 细胞裂解液 | Cell Signaling Technology | 9803 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | 23235 |
| 免疫印迹 | 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | IPVH00010 |
| 免疫荧光 | DAPI | Sigma | -- |
| Leica TCS SP2共聚焦激光显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | RSV感染患儿70例（轻度40例、中度20例）与健康儿童40例的纳入标准、样本采集时间及PBMC分离方法 阅读提示：Methods中Human peripheral blood samples小节及Figure 1a图注 |
| 细胞感染实验 | 各病毒MOI：RSV MOI=10、VSV MOI=1、H1N1 MOI=10、EMCV MOI=10、HSV-1 MOI=10、VSV-GFP MOI=1；HEK293T细胞VSV MOI=0.1；感染时间12或24 h 阅读提示：Methods中Virus infection小节及各Figure图注 |
| 小鼠体内感染 | 小鼠年龄约6-7周、性别雄性、VSV尾静脉8×10^7 p.f.u. g−1（生存实验n=9每组）或腹腔1×10^8 p.f.u. g−1、H1N1 2 MLD50滴鼻；感染剂量与途径需核对原文 阅读提示：Methods中Virus infection小节及Figure 1f,g图注 |
| 蛋白降解实验 | CHX浓度40 μg ml−1、VSV预感染1 h、MG132浓度25 μM（质谱前处理）及处理时间 阅读提示：Figure 3d,e、Figure 6b图注及Methods中Mass spectrometry小节 |
| FBXW7转位突变实验 | FBXW7 NES突变位点I284G及L287/291/293G、F-box结构域缺失突变体构建及转染24 h后VSV感染时间点 阅读提示：Results中The translocation of FBXW7 is critical for RIG-I stabilization部分及Supplementary Fig. 5d |
| SHP2泛素化位点实验 | SHP2 K91R、K178R、558A/562A突变体构建及HA-K48R/K63R Ub的使用；MG132处理6 h 阅读提示：Figure 5h、Figure 6f–k图注及Results对应段落 |