检测TRAF6在肥厚心脏中的表达
验证TRAF6是否在病理性心脏肥大中表达改变
Western blot和免疫组化检测人类DCM/HCM心脏、AB小鼠心脏及Ang II/PE刺激的NRCMs中TRAF6表达
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
泛素E3连接酶TRAF6通过TAK1依赖性信号通路加剧病理性心脏肥大
The ubiquitin E3 ligase TRAF6 exacerbates pathological cardiac hypertrophy via TAK1-dependent signalling.
实验完整度
高包含人类心脏样本、多种基因修饰小鼠模型及NRCM体外实验，并有 ubiquitination、Co-IP、功能回补等多层机制验证
主要模型
人类DCM和HCM患者心脏样本 心脏特异性Traf6过表达（TG）和敲除（CKO）小鼠 主动脉缩窄（AB）及Ang II输注小鼠模型 新生大鼠心肌细胞（NRCMs）和HEK293T细胞
重点核对
AB手术4周后检测心脏肥厚指标（HW/BW、LW/BW、HW/TL）和心功能 Ang II（1.4 mg/kg/天）皮下输注4周 Traf6-TG和Traf6-CKO小鼠在AB或Ang II刺激下的表型比较 Ang II（1 μM）或PE（50 μM）处理NRCMs 48小时检测细胞表面积和ANP/β-MHC表达 5z-7-ox（5 mg/kg）腹腔注射抑制TAK1
摘要
肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）是一种泛素E3连接酶，调控重要的生物学过程。然而，TRAF6在心脏肥大中的作用仍不清楚。在此，我们显示TRAF6水平在人类和小鼠肥大的心脏中增加，并受活性氧（ROS）产生的调控。心脏特异性Traf6过表达加剧压力超负荷或血管紧张素II（Ang II）刺激下的心脏肥大，而Traf6缺失则减轻小鼠的肥厚表型。机制上，我们显示肥厚进展过程中产生的ROS触发TRAF6自身泛素化，促进TAB2的招募及其与转化生长因子β激活激酶1（TAK1）的结合，进而使TRAF6与TAK1直接相互作用并促进TAK1泛素化。TRAF6与TAK1的结合以及TAK1泛素化和激活的诱导对于TRAF6调控的心脏重构不可或缺。综上所述，我们将TRAF6定义为以TAK1依赖性方式导致心脏肥大的关键分子开关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TRAF6在病理性心脏肥大中的作用及其分子机制尚不清楚，本研究旨在探讨TRAF6是否及如何调控心脏肥大。
- 核心机制
- 肥厚刺激产生的ROS诱导TRAF6自身泛素化，促进TAB2招募和TRAF6-TAK1直接结合，进而介导TAK1的K63连接泛素化及激活，激活JNK1/2和p38信号通路。
- 主要证据
- 人类DCM/HCM心脏样本和AB/Ang II小鼠模型中TRAF6表达升高；Traf6过表达加重、缺失减轻心脏肥大；TRAF6-TAK1结合缺陷突变体和E3连接酶失活突变体（C70A）均丧失促肥厚作用；TAK1抑制剂5z-7-ox消除TRAF6过表达的促肥厚效应。
- 研究意义
- TRAF6是病理性心脏肥大的关键分子开关，靶向TRAF6或其与TAK1的相互作用可能成为逆转病理性心脏肥大的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ROS对TRAF6表达的调控
探究肥厚过程中心脏TRAF6升高的原因
检测AB或Ang II输注小鼠心脏ROS含量和NADPH氧化酶活性，并用NAC、APO或CAT干预；NRCMs用H2O2刺激并检测TRAF6表达
体内功能获得和缺失实验
验证TRAF6对压力超负荷和Ang II诱导的心脏肥大的调控作用
构建心脏特异性Traf6过表达（TG）和敲除（CKO）小鼠，进行AB手术或Ang II输注，检测心脏肥厚和功能指标
体外验证TRAF6对心肌细胞肥大的直接作用
验证TRAF6是否直接调控心肌细胞肥大
用AdTraf6或AdshTraf6感染NRCMs，Ang II或PE处理后检测细胞表面积和Anp/β-Mhc表达
验证ROS在TRAF6促肥厚效应中的必要性
确定ROS产生是否介导TRAF6的促肥厚作用
在Traf6-TG和NTG小鼠中给予NAC或APO后行AB手术；在AdTraf6感染的NRCMs中给予NAC或APO后Ang II处理
鉴定TRAF6下游信号通路
确定TRAF6调控心脏肥大的下游信号通路
检测Traf6过表达或缺失对AKT、MAPK及上游激酶磷酸化的影响；在NRCMs中验证TAK1-JNK/p38通路
验证TAK1在TRAF6促肥厚效应中的必要性
确定TAK1激活是否为TRAF6促肥厚作用所必需
在NRCMs中共转染AdTraf6与AddnTak1或AdshTraf6与AdcaTak1；在Traf6-TG和NTG小鼠中使用TAK1抑制剂5z-7-ox
解析TRAF6泛素化及TAK1泛素化机制
阐明ROS如何激活TRAF6以及TRAF6如何激活TAK1
体内外泛素化实验检测TRAF6和TAK1的泛素化；Co-IP和GST pull-down验证TRAF6-TAK1相互作用及TAB2招募；构建TRAF6和TAK1截短体定位结合域
验证TRAF6-TAK1相互作用和E3连接酶活性的体内必要性
确定TRAF6与TAK1的结合及TRAF6的E3连接酶活性在心脏肥厚中的必要性
构建心脏特异性过表达TRAF6突变体（Δ358-522，即TMTG）和TRAF6 C70A突变体小鼠，进行AB手术
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 |
| p-AKTSer473抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| MEK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9122 | |
| p-MEK1/2Ser217/221抗体 | Cell Signaling Technology | 9154 | |
| ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| p-ERK1/2Thr202/Tyr204抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| p-JNKThr183/Tyr185抗体 | Cell Signaling Technology | 4668 | |
| p38抗体 | Cell Signaling Technology | 9212 | |
| p-p38Thr180/Tyr182抗体 | Cell Signaling Technology | 4511 | |
| TAK1抗体 | Cell Signaling Technology | 4505 | |
| p-TAK1Ser412抗体 | Cell Signaling Technology | 9339 | |
| TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3013 | |
| p-TBK1Ser172抗体 | Cell Signaling Technology | 5483 | |
| PI3-激酶p85抗体 | Cell Signaling Technology | 4257 | |
| p-PI3-激酶p85Tyr458抗体 | Cell Signaling Technology | 4228 | |
| p-FAKTyr925抗体 | Cell Signaling Technology | 3284 | |
| TAB2抗体 | Cell Signaling Technology | 3715 | |
| Actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3933 | |
| TRAF6抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc7221 | |
| ANP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc20158 | |
| β-MHC抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc53090 | |
| p-ASK1Ser966抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc101634 | |
| ILK抗体 | Abcam | ab76468 | |
| p-ILK (S343)抗体 | Abgent | AP3679a | |
| ASK1抗体 | Gene Tex | GTX107921 | |
| GAPDH抗体 | Bioworld Technology | MB001 | |
| FAK抗体 | Bioworld Technology | BS3853 | |
| HA抗体 | Sigma | H6908 | |
| FLAG抗体 | Sigma | F3165 | |
| 蛋白质浓度测定 | BCA蛋白测定试剂盒 | Pierce | -- |
| Western blot | 辣根过氧化物酶标记二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | -- |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | HyClone | -- |
| 动物实验 | 他莫昔芬 | Sigma | T-5648 |
| 血管紧张素II | -- | -- | |
| 渗透压泵 | Alzet | 2004 | |
| 5Z-7-氧杂蒽酮 | Sigma | O9890-1MG | |
| 免疫荧光 | α-actinin抗体 | Merck Millipore | 05-384 |
| ROS检测 | 二氢乙锭 | Invitrogen | -- |
| 2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯 | Invitrogen | -- | |
| 免疫组化 | 辣根过氧化物酶标记二抗 | Abbkine | A21020 |
| Western blot | 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596-026 |
| Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒 | Roche | 4897030001 | |
| SYBR Green | Roche | O4887352001 | |
| 免疫共沉淀 | 蛋白酶抑制剂片剂 | Roche | 04693132001 |
| 蛋白A/G琼脂糖珠 | Roche | 11719394001 and 11719386001 | |
| 蛋白G琼脂糖 | Roche | 11243233001 | |
| GST pull-down | FLAG肽 | Sigma | F4799 |
| 谷胱甘肽-Sepharose 4B珠 | GE Healthcare Biosciences AB | 17075601 | |
| 体外泛素化 | TNT快速偶联转录/翻译系统试剂盒 | Promega | L2080 |
| 泛素化试剂盒 | Enzo Life Sciences | BML-UW9920-0001 | |
| 链霉亲和素-辣根过氧化物酶 | Abcam | ab7403 | |
| 抗TAK1抗体 | Cell Signaling Technology | 5206 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TRAF6表达检测 | 人类心脏样本分组和数量（正常n=6、DCM n=7、HCM n=5），AB小鼠时间点和每组只数（n=4），NRCMs处理浓度（Ang II 1 μM、PE 50 μM）和时间（12、24、48小时） 阅读提示：Figure 1图注和Methods中Western blotting与细胞培养部分 |
| ROS调控TRAF6表达 | NAC（500 mg/kg/天）、APO（100 mg/kg/天）给药方式和时长，CAT（400 U/ml）、NAC（10 mM）、APO（100 μM）体外浓度，H2O2刺激时间（6-48小时） 阅读提示：Figure 2图注和Methods中动物模型与细胞培养部分 |
| 体内Traf6功能实验 | TG和CKO小鼠品系（TG2、TG4）、AB手术4周、Ang II输注剂量（1.4 mg/kg/天）和时长（4周）、tamoxifen诱导方案（80 mg/kg/天连续5天）、每组动物数（11-13只） 阅读提示：Figure 3、Supplementary Figure 2-3图注和Methods中Animal models and procedures部分 |
| NRCM体外肥大实验 | 腺病毒感染MOI（100）和时长（24小时），Ang II（1 μM）或PE（50 μM）处理48小时，α-actinin染色和细胞表面积定量方法 阅读提示：Figure 4图注和Methods中Cell culture and recombinant adenovirus generation部分 |
| TAK1抑制剂实验 | 5z-7-ox剂量（5 mg/kg）和给药方式（腹腔注射），AB手术4周，NTG和Traf6-TG小鼠分组 阅读提示：Figure 8图注和Methods中Animal models and procedures部分 |
| 泛素化和相互作用实验 | Ang II处理时间（15分钟），H2O2处理时间（15分钟），TRAF6 C70A突变体，K63-Ub和K48-Ub质粒，Co-IP和GST pull-down抗体 阅读提示：Figure 9-12图注和Methods中Immunoprecipitation and GST pull-down assays、In vivo/in vitro ubiquitination assay部分 |