ROR1敲低对多种RTK磷酸化的影响
验证ROR1是否维持多种RTK的磷酸化信号
在NCI-H1975和PC-9细胞中用siROR1处理，采用人磷酸化RTK阵列检测49种RTK磷酸化状态，并用生长因子刺激检测RTK及AKT磷酸化
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ROR1 作为 cavin-1 和 caveolin-1 的支架维持小窝结构与生存信号
ROR1 sustains caveolae and survival signalling as a scaffold of cavin-1 and caveolin-1.
实验完整度
高包含多种NSCLC细胞系体外模型及IP-WB、GST pull-down、电镜、超分辨成像等多层机制验证
主要模型
NCI-H1975肺腺癌细胞系 PC-9肺腺癌细胞系 A431外阴表皮癌细胞系 COS-7细胞系
重点核对
siRNA转染浓度20 nM，转染后72 h收获用于多数分析（IP-WB分析cavin-1与CAV1相互作用为24 h） 多种生长因子刺激浓度50 ng/ml、刺激30 min，包括IGF-I、IGF-II、insulin、PDGF、HGF TKI处理：gefitinib 1 μM或CL-387,785 0.5 μM，与50 ng/ml IGF-I或HGF共处理6 h 溶酶体抑制剂chloroquine 100 μM、蛋白酶体抑制剂MG262 10 nM，连续暴露48 h ROR1敲低后质膜小窝数量统计不少于18个随机质膜区域（17–50 μm²）
摘要
受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）在肺腺癌中直接位于谱系生存癌基因NKX2-1/TTF-1下游，维持促生存信号。本文报道该受体酪氨酸激酶（RTK）一个意外的功能，即作为cavin-1和caveolin-1（CAV1）这两种小窝必需结构组分的支架。ROR1这一不依赖激酶的功能促进cavin-1和CAV1在质膜上的相互作用，从而阻止CAV1的溶酶体降解，进而维持小窝结构以及通过多种RTK向AKT的促生存信号。这些发现为ROR1抑制如何克服因MET和IGF-IR等多种RTK旁路信号导致的EGFR–酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药提供了机制解释，该耐药是目前临床上的一大障碍。鉴于ROR1的癌胚表达特征，抑制肺腺癌患者中ROR1的支架功能是改善这一致命癌症治疗的一种有吸引力的途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ROR1如何维持非小细胞肺癌中多种RTK的信号传导，以及ROR1抑制能否克服旁路信号介导的EGFR–TKI耐药。
- 核心机制
- ROR1以不依赖激酶活性的方式作为cavin-1和CAV1的支架，促进二者在质膜上的相互作用，阻止CAV1的溶酶体降解，从而维持小窝结构及多种RTK向AKT的促生存信号。
- 主要证据
- 在NCI-H1975、PC-9等细胞中，siROR1或siCAV1降低多种RTK磷酸化；ROR1敲低降低CAV1蛋白但不影响其mRNA，chloroquine可挽救而MG262不能；IP-WB和GST pull-down证实ROR1与cavin-1、CAV1结合并定位其结合区域；激酶失活ROR1可同样挽救CAV1表达和DRM定位；ROR1敲低减少小窝结构并增加CAV1与LAMP-1共定位。
- 研究意义
- 作者提出抑制ROR1的支架功能可通过破坏小窝结构抑制广谱RTK的促生存信号，是克服MET、IGF-IR等旁路信号所致EGFR–TKI耐药的潜在策略，且基于ROR1的癌胚表达特征具有肿瘤特异性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ROR1对CAV1表达及小窝结构的维持
验证ROR1是否维持CAV1表达和小窝结构
用三条独立ROR1 siRNA敲低ROR1，WB和免疫荧光检测CAV1/CAV2表达；RT-PCR检测CAV1 mRNA；氯喹和MG262处理检测降解途径；冷冻断裂复型电镜和免疫电镜观察小窝结构
ROR1与cavin-1、CAV1的结合及区域定位
验证ROR1是否与cavin-1和CAV1结合并确定结合区域
用octylglucoside裂解进行IP-WB，用纯化的GST标签蛋白进行pull-down，构建多种ROR1和cavin-1缺失突变体定位结合区域，并用缺失结合区域的ROR1突变体进行CAV1挽救实验
ROR1激酶活性依赖性验证
验证ROR1维持CAV1和小窝结构是否需要其激酶活性
用siRNA抗性的野生型和激酶失活ROR1进行挽救实验，蔗糖密度梯度离心检测DRM中CAV1和cavin-1，检测SRC抑制剂及cavin-1磷酸化位点突变的影响
ROR1抑制克服旁路信号介导的EGFR–TKI耐药
验证抑制ROR1、cavin-1或CAV1能否克服IGF-I或HGF介导的EGFR–TKI耐药
在A431、PC-9和NCI-H1975细胞中敲低ROR1、cavin-1或CAV1，联合gefitinib或CL-387,785与IGF-I或HGF处理，检测RTK和AKT磷酸化及细胞增殖
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 吉非替尼 | Biaffin GmbH & Co KG | -- |
| 达沙替尼 | Selleckchem | -- | |
| CL-387, 785 | Calbiochem | -- | |
| SKI-I | Calbiochem | -- | |
| 细胞因子处理 | 重组肝细胞生长因子 | PeproTech | -- |
| 重组胰岛素样生长因子I | PeproTech | -- | |
| 重组胰岛素样生长因子II | PeproTech | -- | |
| 重组胰岛素 | Sigma | -- | |
| 重组血小板衍生生长因子 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 溶酶体与蛋白酶体抑制 | 氯喹 | Sigma | -- |
| MG262 | Sigma | -- | |
| Western blot | 抗ROR1抗体 | Cell Signaling Technology | 4102 |
| 抗IGF-IR抗体 | Cell Signaling Technology | 3027 | |
| 抗PDGFR抗体 | Cell Signaling Technology | 3164 | |
| 抗c-MET抗体 | Cell Signaling Technology | 3127 | |
| 抗ERBB2抗体 | Cell Signaling Technology | 2165 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| 抗ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| 抗c-Src抗体 | Cell Signaling Technology | 2109 | |
| 抗S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 9202 | |
| 抗磷酸化IGF-IR抗体 | Cell Signaling Technology | 3024 | |
| 抗磷酸化胰岛素受体抗体 | Cell Signaling Technology | 3024 | |
| 抗磷酸化PDGFR抗体 | Cell Signaling Technology | 2992 | |
| 抗磷酸化c-MET抗体 | Cell Signaling Technology | 3126 | |
| 抗磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9271 | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4377 | |
| 抗磷酸化c-Src抗体 | Cell Signaling Technology | 2101 | |
| 抗磷酸化S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 9205 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Sigma | T9026 | |
| 抗c-myc抗体 | SantaCruz | sc-40 | |
| 抗转铁蛋白受体抗体 | Invitrogen | 13–6,800 | |
| 抗cavin-1抗体 | Bethyl Laboratories | A301-271 A | |
| 抗GST抗体 | MBL | M071-3 | |
| 免疫沉淀 | 抗ROR1抗体 | R&D systems | AF2000 |
| Western blot | 抗胰岛素受体抗体 | Abcam | ab69508 |
| 免疫荧光 | 抗ROR1抗体 | Abcam | ab111174 |
| 抗CAV2抗体 | Abcam | ab75865 | |
| 抗CAV1抗体 | Abcam | ab18199 | |
| 抗LAMP-1抗体 | Abcam | ab24170 | |
| 抗cavin-1抗体 | Abcam | ab135655 | |
| Western blot/免疫荧光 | 抗CAV1抗体 | BD Bioscience | 610407 |
| Western blot | 抗CAV2抗体 | BD Bioscience | 610685 |
| 抗EGFR抗体 | BD Bioscience | 610017 | |
| 抗小鼠IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 抗兔IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo Laboratories | -- |
| 磷酸化RTK检测 | 人磷酸化RTK阵列试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 细胞组分分离 | ProteoExtract亚细胞蛋白质组提取试剂盒 | Calbiochem | -- |
| 质粒转染 | FuGENE6转染试剂 | Promega | -- |
| 定量RT-PCR | Power SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- |
| ABI Prism7500实时PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 重组蛋白纯化 | c-Myc标签蛋白温和纯化试剂盒 | MBL | -- |
| GST pull-down | GST标签cavin-1野生型蛋白 | Abnova | -- |
| GST标签cavin-1膜结合结构域蛋白 | Abnova | -- | |
| GST标签cavin-2野生型蛋白 | Abnova | -- | |
| GST标签CAV1蛋白 | Abcam | -- | |
| 免疫荧光 | Zenon Alexa Fluor 488抗体标记试剂盒 | Life Technologies | Z-25302 |
| Zenon Alexa Fluor 568抗体标记试剂盒 | Life Technologies | Z-25306 | |
| Alexa-488二抗 | Invitrogen | A11055 | |
| Alexa-568二抗 | Invitrogen | A11031 | |
| Alexa-350二抗 | Invitrogen | A11046 | |
| DAPI溶液 | Dojindo Laboratories | -- | |
| Fluoromount封片剂 | Diagnostic BioSystems | -- | |
| 超分辨成像 | Vectashield H-1,000封片剂 | Vector Laboratories | -- |
| 电子显微镜 | JEM-1011电子显微镜 | JEOL | -- |
| 冷冻断裂 | BAF400冷冻断裂装置 | Baltec | -- |
| 高压冷冻 | HPM 010高压冷冻机 | Leica | -- |
| 冷冻蚀刻 | FR 9000冷冻蚀刻装置 | Hitachi | -- |
| 蔗糖密度梯度离心 | SW41Ti转子 | Beckman | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| siRNA敲低实验 | siRNA浓度20 nM、转染试剂、收获时间（多数72 h，cavin-1与CAV1相互作用分析24 h） 阅读提示：Methods中RNA interference小节 |
| 生长因子刺激与RTK磷酸化检测 | 生长因子种类及浓度50 ng/ml、刺激时间30 min、血清饥饿24 h 阅读提示：Methods中Ligand and/or TKI treatment in siRNA-treated cells小节及Fig. 1b图注 |
| TKI耐药挽救实验 | gefitinib 1 μM或CL-387,785 0.5 μM、IGF-I或HGF 50 ng/ml、处理6 h（WB）或4天（增殖）、n=3 阅读提示：Methods中Ligand and/or TKI treatment小节及Fig. 8图注 |
| 溶酶体降解途径验证 | chloroquine 100 μM、MG262 10 nM、连续暴露48 h 阅读提示：Methods中Lysosomal inhibitor treatment in cells knocked down for ROR1小节及Fig. 2c图注 |
| 小窝结构电镜观察 | 每样本随机质膜区域数≥18、区域面积17–50 μm²、统计方法Student t检验 阅读提示：Fig. 2e图注及Methods中Electron microscopy小节 |
| ROR1与cavin-1/CAV1结合实验 | octylglucoside缓冲液组成、IP抗体、缺失突变体构建 阅读提示：Methods中WB and IP–WB analyses及Constructs小节 |