验证TARBP2体内外SUMO化修饰
确认TARBP2是否可被SUMO蛋白修饰及主要修饰类型
在293T细胞中共转染His-SUMO1/2/3、Flag-Ubc9和myc-TARBP2，用Ni2+-NTA树脂pull down检测SUMO化；共转染Flag-TARBP2、GFP-SUMO1和HA-Ubc9，免疫共沉淀检测共价结合；在稳定过表达His-SUMO1的HeLa细胞中检测内源性TARBP2 SUMO化。
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TARBP2的SUMO化修饰调控miRNA/siRNA效率
SUMOylation of TARBP2 regulates miRNA/siRNA efficiency.
实验完整度
高包含体外SUMO化、细胞系、动物移植瘤模型及多组功能与机制验证
主要模型
293T细胞系 HeLa细胞系 A549luc细胞系 BALB/c裸鼠移植瘤模型
重点核对
TARBP2 SUMO化位点为K52，K52R突变体在真核细胞中SUMO化几乎完全消失 TARBP2-WT半衰期约7小时，K52R突变体约3-4小时（HeLa和293T细胞） A549luc稳定细胞系中，TARBP2-K52R组软琼脂克隆形成数显著多于WT组 裸鼠皮下注射2.5×10^6个A549luc细胞，6周后TARBP2-K52R组瘤重显著大于WT组 TARBP2-K52R与Ago2结合减少，且Ago2半衰期在K52R细胞中缩短
摘要
小RNA诱导的基因沉默对于基因表达的转录后调控至关重要；然而，miRNA/siRNA效率如何被调控仍不清楚。本研究表明TARBP2在K52位点发生SUMO化修饰，且该修饰可被其磷酸化增强。该修饰通过抑制TARBP2的K48连接的泛素化而稳定TARBP2。我们发现TARBP2的SUMO化不影响成熟miRNA的整体产生，但调控miRNA/siRNA效率。SUMO化的TARBP2招募Ago2以构成RNA诱导沉默复合物（RISC）装载复合物（RLC），同时促进更多pre-miRNA装载到RLC中。因此，Ago2被稳定，且TARBP2/Dicer结合的miRNA/siRNA被有效转移至Ago2。这些过程导致形成有效的RNA干扰（RNAi）RISC。总之，我们的数据表明TARBP2的SUMO化是调控miRNA/siRNA效率所必需的，这是miRNA/siRNA调控的一种普遍机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- miRNA/siRNA效率如何被调控尚不清楚，本研究探究TARBP2的SUMO化修饰是否以及如何调控miRNA/siRNA效率。
- 核心机制
- TARBP2在K52位点发生SUMO化，该修饰可被MAPK/Erk介导的磷酸化增强；SUMO化通过抑制K48连接的泛素化稳定TARBP2，并促进TARBP2与pre-miRNA及Ago2的结合（SUMO1与Ago2的SIMs直接相互作用），从而招募Ago2形成功能性RISC，提高miRNA/siRNA效率。
- 主要证据
- 利用293T、HeLa、A549luc等细胞系进行SUMO化、泛素化、蛋白质稳定性、RNA免疫沉淀、双荧光素酶报告基因、软琼脂克隆形成、伤口愈合和RTCA迁移实验，以及裸鼠移植瘤模型，证明TARBP2 SUMO化调控miRNA/siRNA效率并可能抑制肿瘤进展。
- 研究意义
- 本研究首次证明TARBP2可被SUMO1修饰，且该修饰调控miRNA/siRNA效率，提出了miRNA/siRNA调控的一种普遍机制，并提示TARBP2 SUMO化可能与肿瘤发生相关。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定TARBP2主要SUMO化位点
确定TARBP2发生SUMO化的关键赖氨酸残基
根据SUMOPlot预测将K52突变为R，在293T细胞和大肠杆菌BL21系统中进行SUMO化 assay，比较WT与K52R的SUMO化水平；并检测缺氧和H2O2处理对SUMO化的影响。
验证磷酸化对TARBP2 SUMO化的调控
探究MAPK/Erk介导的磷酸化是否影响TARBP2 SUMO化
构建TARBP2 S142/152/283/286位点突变体（SΔA和SΔD），在293T细胞中检测SUMO化；过表达Erk1或使用U0126抑制Erk活性后检测SUMO化。
验证SUMO化对TARBP2稳定性和泛素化的影响
确定SUMO化是否通过抑制泛素化稳定TARBP2
在293T细胞中共转染TARBP2、HA-泛素及Ubc9/SUMO1，检测泛素化；使用Ub-K48R突变体确定泛素化类型；用CHX处理稳定表达TARBP2-WT或K52R的HeLa和293T细胞，检测半衰期；在Senp1或SUMO1敲低细胞中检测内源性TARBP2表达和半衰期。
评估TARBP2 SUMO化对肿瘤细胞生长和迁移的影响
探究TARBP2 SUMO化是否影响肿瘤进展
在A549luc和M12luc细胞中稳定表达TARBP2-WT或K52R，进行软琼脂克隆形成实验；将A549luc细胞皮下注射到裸鼠，监测肿瘤生长；用RTCA和伤口愈合实验检测细胞迁移。
验证SUMO化对miRNA产生和pre-miRNA结合的影响
确定SUMO化是否影响成熟miRNA产生及TARBP2与pre-miRNA的结合
对稳定表达TARBP2-WT或K52R的A549luc细胞进行小RNA测序和qPCR检测成熟miRNA；在293T细胞中转染pri-miR21或pre-miR21，进行RNA免疫沉淀检测TARBP2与pre-miRNA的结合；在Senp1敲低细胞中验证SUMO化对结合的影响。
验证SUMO化对TARBP2与Ago2结合及Ago2稳定性的影响
探究SUMO化是否促进TARBP2与Ago2的相互作用并稳定Ago2
在293T细胞中共转染Flag-TARBP2-WT或K52R与myc-Ago2，免疫共沉淀检测结合；使用H2O2处理增强SUMO化后检测结合；构建Ago2 SIM1/SIM2突变体，验证SUMO1与SIMs的结合；在TARBP2敲低细胞中回补WT或K52R，检测Ago2表达；用CHX处理检测Ago2半衰期。
验证SUMO化对miRNA/siRNA沉默效率的影响
确定TARBP2 SUMO化是否调控RISC功能和基因沉默效率
在293T细胞中进行双荧光素酶报告基因实验检测miR21结合；在A549luc稳定细胞系中共表达pri-miR21或pri-miR130b与TARBP2-WT或K52R，检测PTEN和ZEB1蛋白水平；在HeLa细胞中共转染miRNA mimic或siRNA与TARBP2-WT或K52R，检测靶蛋白；用RIP检测Ago2结合的成熟miR21。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | Biowest | -- | |
| 青霉素和链霉素 | Invitrogen | -- | |
| RPMI 1640培养基 | Hyclone | -- | |
| 两性霉素B | Sagon | -- | |
| 表皮生长因子 | Roche | -- | |
| 地塞米松 | Sigma | -- | |
| 胰岛素 | Sigma | -- | |
| 转铁蛋白 | Sigma | -- | |
| 庆大霉素 | Sagon | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| SUMO化实验 | Ni2+-NTA琼脂糖珠 | Qiagen | -- |
| GST pull-down | 谷胱甘肽琼脂糖4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0756-01 |
| 免疫沉淀 | Protein G Plus/Protein A琼脂糖悬浮液 | Calbiochem | IP05 |
| Erk抑制实验 | U0126 | Sigma | U120 |
| SUMO化调控实验 | 过氧化氢溶液 | Sigma | H1009 |
| 病毒感染 | 聚凝胺（溴化己二甲铵） | Sigma | H9268 |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Sigma | P8833 |
| miRNA/siRNA功能实验 | miR21模拟物 | GenePharma | -- |
| miR130b模拟物 | GenePharma | -- | |
| PTEN siRNA | GenePharma | -- | |
| Western blot | 抗TARBP2抗体 | ProteinTech Group | 15753-1-AP |
| 抗His标签抗体 | ProteinTech Group | 66005-1-Ig | |
| 抗GST抗体 | CWbioTech | CW0084 | |
| 抗Ago2抗体 | Cell Signaling Technology | 2897 | |
| 抗ZEB1抗体 | Cell Signaling Technology | 3396 | |
| 抗PTEN抗体 | Cell Signaling Technology | 9188 | |
| 抗Dicer抗体 | Cell Signaling Technology | 3363 | |
| 抗磷酸化p44/42-Erk1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗p44/42-Erk1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 抗Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 2276 | |
| 抗GFP抗体 | Cell Signaling Technology | 2956 | |
| 抗β-Actin抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗Flag M2抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗HA抗体 | Sigma | MMS-101 P | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab37168 | |
| 抗SUMO1抗体 | Abcam | ab32058 | |
| 抗Senp1抗体 | Abcam | ab108981 | |
| qRT-PCR | TRIZOL试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript RT-PCR试剂盒 | TAKARA | RR037A | |
| SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | 4309155 | |
| RNA免疫沉淀 | RNase抑制剂 | Fermentas | -- |
| 钒基核糖核苷复合物 | New England BioLabs | -- | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| 迁移实验 | μ-Dish培养皿（35mm高） | IBIDI | -- |
| xCELLigence RTCA-DP实时细胞分析仪 | Roche | -- | |
| 软琼脂克隆形成实验 | 琼脂 | Amresco | -- |
| 动物活体成像 | D-荧光素 | Xenogen | -- |
| 活体成像 | IVIS成像系统 | Xenogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TARBP2 SUMO化位点鉴定 | K52R突变体构建及SUMO化检测体系（293T细胞转染His-SUMO1/Flag-Ubc9，Ni2+-NTA pull down） 阅读提示：Methods 'SUMOylation assays'及Figure 2a legend |
| TARBP2稳定性检测 | CHX浓度100 μg/ml，处理时间进程，HeLa和293T稳定细胞系 阅读提示：Figure 4d legend及Methods 'Antibodies and reagents' |
| miRNA/siRNA效率检测 | miR21/miR130b mimic或siPTEN转染浓度，双荧光素酶报告基因体系，PTEN/ZEB1检测 阅读提示：Figure 8e–g legend及Methods 'Antibodies and reagents' |
| 裸鼠移植瘤实验 | A549luc细胞接种量2.5×10^6/只，皮下注射，n=4，6周后评估 阅读提示：Methods 'Xenograft tumour model'及Figure 5c legend |
| 软琼脂克隆形成实验 | 细胞接种密度2,000/孔，琼脂浓度0.35%和0.6%，培养12天 阅读提示：Figure 5b legend及Methods 'Soft agar colony formation assay' |