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        线粒体解偶联将脂质分解代谢与Akt抑制及抗肿瘤发生联系起来

        Mitochondrial uncoupling links lipid catabolism to Akt inhibition and resistance to tumorigenesis.

        作者信息Sara M Nowinski, Ashley Solmonson, Joyce E Rundhaug, Okkyung Rho, Jiyoon Cho, Cory U Lago, Christopher L Riley, Sunhee Lee, Shohei Kohno, Christine K Dao, Takeshi Nikawa, Shawn B Bratton, Casey W Wright, Susan M Fischer, John DiGiovanni, Edward M Mills
        PMID26310111
        期刊Nat Commun
        发布时间2015-08-27
        DOI10.1038/ncomms9137
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含体外细胞、转基因小鼠模型、原代人角质形成细胞及代谢组学等多层级证据，并有功能挽救实验验证机制。

        主要模型

        K5-UCP3转基因小鼠 K5-Akt转基因小鼠 Tg.AC转基因小鼠 原代小鼠角质形成细胞 原代人新生儿角质形成细胞

        重点核对

        K5-UCP3小鼠通过牛角蛋白5启动子靶向基底表皮过表达UCP3 两阶段化学致癌实验使用DMBA（100 µg）启动，TPA（2.5 µg）促进 Tg.AC小鼠实验使用TPA（2.5 µg）处理16周龄小鼠，每周两次共4次 局部处理TPA剂量为2.5 µg，OA为5 nmol，Eto为1 mg BrdU标记实验每组n=3只动物，计数>500个细胞

        摘要

        为了支持生长，肿瘤细胞重编程其代谢，在维持能量产生的同时上调大分子生物合成。解偶联蛋白（UCPs）通过诱导与ATP合成解偶联的无效线粒体呼吸来对抗这一表型，导致营养浪费。在此，我们使用靶向基底表皮的UCP3转基因，展示强制线粒体解偶联通过阻断Akt激活来抑制皮肤癌发生。同样，在过表达UCP3的原代人角质形成细胞中，Akt激活被显著抑制。机制研究表明，解偶联增加脂肪酸氧化和膜磷脂分解代谢，并损害Akt向质膜的募集。Akt的过表达克服了UCP3的代谢调节，挽救了癌发生。这些发现表明，线粒体解偶联是通过抑制Akt来限制增殖和肿瘤发生的有效策略，并揭示了线粒体代谢与生长信号传导之间交叉对话的新机制。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        线粒体解偶联是否通过调节生长信号通路来抑制肿瘤发生？
        核心机制
        UCP3介导的线粒体解偶联增加脂肪酸氧化和膜磷脂分解代谢，减少Akt向质膜的募集，从而抑制Akt激活；PP2A过度激活也部分贡献于Akt抑制。
        主要证据
        在K5-UCP3小鼠中，TPA诱导的皮肤肿瘤发生被抑制，Akt磷酸化降低；在原代人角质形成细胞中UCP3过表达同样抑制EGF诱导的Akt激活；Akt过表达可挽救K5-UCP3小鼠的肿瘤发生。
        研究意义
        这些发现表明线粒体解偶联是通过抑制Akt来限制增殖和肿瘤发生的有效策略，并揭示了线粒体代谢与生长信号传导之间交叉对话的新机制，可能为未来治疗策略提供靶点。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        建立UCP3转基因小鼠并验证线粒体解偶联

        确认K5-UCP3小鼠中UCP3在基底表皮表达且线粒体解偶联增强。

        使用K5-UCP3转基因小鼠，通过TMRM染色和流式细胞术检测线粒体膜电位，用ApoSENSOR试剂盒测定ATP水平。

        2

        评估UCP3对化学致癌和肿瘤促进的影响

        验证UCP3过表达是否抑制肿瘤发生和肿瘤促进阶段。

        使用两阶段化学致癌模型（DMBA启动，TPA促进）和Tg.AC小鼠模型，观察肿瘤发生率和多样性；用BrdU标记检测TPA诱导的表皮增殖。

        3

        分析UCP3对Akt信号通路的影响

        确定UCP3是否抑制Akt激活及其下游靶点。

        通过免疫印迹检测TPA或EGF处理后表皮或原代角质形成细胞中Akt（S473、T308）及其靶点（GSK-3β、FOXO1、TSC2）的磷酸化，以及EGFR、mTOR通路的变化。

        4

        探究UCP3抑制Akt的机制：PP2A和脂质代谢

        明确PP2A活性和脂质分解代谢在UCP3诱导的Akt抑制中的作用。

        测定PP2A催化活性，使用OA抑制PP2A；用代谢组学分析脂质代谢物；检测脂肪酸氧化和Akt膜定位；使用etomoxir抑制脂肪酸氧化。

        5

        通过Akt过表达挽救实验验证Akt的核心作用

        测试Akt过表达是否克服UCP3的代谢调节并恢复肿瘤发生。

        将K5-UCP3与K5-Akt小鼠杂交，获得双转基因小鼠，进行两阶段化学致癌实验，观察肿瘤发生和增殖。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证模型特征
        流式细胞术ATP生物发光检测免疫组织化学
        验证细胞增殖
        BrdU标记
        验证分子表达与信号通路
        免疫印迹亚细胞组分分离PP2A活性检测
        验证代谢变化
        代谢组学分析脂肪酸氧化检测活性氧检测
        评估体内肿瘤发生
        两阶段化学致癌实验肿瘤发生率和多样性评分
        数据分析与统计
        Student t检验方差分析及Dunnett事后检验Welch t检验基因本体分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        药物处理12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯LC Laboratories--
        冈田酸LC Laboratories--
        乙莫克舍乙酯US Biological--
        细胞培养胰蛋白酶Life Technologies--
        胰蛋白酶-EDTALife Technologies--
        角质形成细胞无血清培养基Life Technologies--
        Hank平衡盐溶液Life Technologies--
        中性蛋白酶Life Technologies--
        庆大霉素Life Technologies--
        两性霉素BLife Technologies--
        流式分析四甲基罗丹明甲酯Life Technologies--
        线粒体绿色荧光探针Life Technologies--
        转染Lipofectamine 2000转染试剂Life Technologies--
        ATP测定ApoSENSOR ADP/ATP比率生物发光检测试剂盒BioVision Inc.--
        流式分析尼罗红Sigma--
        免疫印迹RIPA裂解液Roche--
        蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物Roche--
        磷酸化Akt S473抗体Cell Signaling Technology9271S
        磷酸化Akt T308抗体Cell Signaling Technology9275S
        Akt抗体Cell Signaling Technology9272S
        磷酸化FOXO1 S256抗体Cell Signaling Technology9461
        磷酸化FOXO1 S319抗体Cell Signaling Technology2486
        磷酸化GSK-3β S9抗体Cell Signaling Technology5558
        GSK-3β抗体Cell Signaling Technology12456
        磷酸化TSC2 S939抗体Cell Signaling Technology3615
        磷酸化mTOR S2448抗体Cell Signaling Technology5536
        磷酸化mTOR S2481抗体Cell Signaling Technology2974
        mTOR抗体Cell Signaling Technology2983
        磷酸化4EBP1 T36/47抗体Cell Signaling Technology2855
        4EBP1抗体Cell Signaling Technology9644P
        磷酸化rS6 T240/244抗体Cell Signaling Technology5364
        rS6抗体Cell Signaling Technology2217
        磷酸化eIF4G S1108抗体Cell Signaling Technology2441
        磷酸化EGFR Y1086抗体Cell Signaling Technology2220S
        EGFR抗体Cell Signaling Technology4267P
        磷酸化p38 MAPK T180/Y182抗体Cell Signaling Technology9211S
        p38 MAPK抗体Cell Signaling Technology9212
        PTEN抗体Cell Signaling Technology9188S
        PP2Ac抗体Cell Signaling Technology2259
        PP2Aa抗体Cell Signaling Technology2041P
        磷酸化ERK T202/Y204抗体Cell Signaling Technology4370
        ERK抗体Cell Signaling Technology9102
        磷酸化p90 RSK T359/S363抗体Cell Signaling Technology9344
        p90 RSK抗体Cell Signaling Technology9347
        PKCα抗体Cell Signaling Technology2056
        β-肌动蛋白抗体Cell Signaling Technology4970S
        细胞周期蛋白D1抗体Santa Cruz BiotechnologySC-753
        细胞周期蛋白A抗体Santa Cruz BiotechnologySC-596
        p21抗体Santa Cruz BiotechnologySC-6246
        p27抗体Santa Cruz BiotechnologySC-1641
        α-微管蛋白抗体Santa Cruz BiotechnologySC-51500
        α3整合素抗体ChemiconAB1920
        UCP3抗体Washington Biotechnology--
        辣根过氧化物酶标记抗兔抗体GE HealthcareNA934V
        辣根过氧化物酶标记抗鼠抗体GE HealthcareNA931V
        化学发光底物Thermo Scientific--
        PP2A活性检测孔雀石绿检测Millipore--
        ROS检测Amplex Red试剂Life Technologies--
        2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯Life Technologies--
        二氢乙锭Life Technologies--
        基因表达分析TRIzol试剂Invitrogen--
        QIAGEN RNeasy试剂盒QIAGEN--
        Illumina Mouse-6_V1 BeadChip芯片Illumina--
        脂肪酸氧化测定Clark型电极Instech--

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        两阶段化学致癌实验
        DMBA剂量100 µg，TPA剂量2.5 µg，TPA处理持续26周，每组小鼠数量（WT n=28，K5-UCP3 n=27，K5-Akt n=29，K5-UCP3/K5-Akt n=18）
        阅读提示：Methods部分Tumor experiments小节及Figure 6a时间线
        Tg.AC肿瘤实验
        小鼠年龄16周，TPA剂量2.5 µg，每周两次共4次，每组n=20
        阅读提示：Methods部分Tumor experiments小节及Figure 1a时间线
        BrdU标记实验
        BrdU注射剂量10 mg/kg，注射后30分钟取材，每组n=3只动物，计数>500个细胞
        阅读提示：Methods部分BrdU labeling & histology小节及Figure 1g、Figure 5c图注
        局部处理实验
        TPA剂量2.5 µg，OA剂量5 nmol，Eto剂量1 mg，处理体积200 µL，取材时间点（4小时、18小时等）
        阅读提示：Methods部分Topical treatments小节及Figure 2、Figure 4图注
        原代角质形成细胞信号实验
        EGF浓度40 ng/mL，血清饥饿条件，转染方法（Lipofectamine 2000）
        阅读提示：Methods部分Primary cell signaling experiments and transfection小节及Figure 2d-f图注

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