AhR与Oct4表达相关性分析
探究AhR与Oct4在多种细胞系及分化过程中的表达关系
qRT-PCR和免疫印迹检测10种人细胞系中AHR与POU5F1 mRNA及蛋白水平；RA诱导NCCIT分化过程中检测两基因mRNA变化
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色氨酸衍生物调控类干细胞癌细胞中Oct4的转录
Tryptophan derivatives regulate the transcription of Oct4 in stem-like cancer cells.
实验完整度
高包含体外细胞系、肿瘤球、多种异种移植瘤模型及EMSA/ChIP机制验证
主要模型
U87胶质瘤细胞系 NCCIT胚胎癌细胞系 U87肿瘤球（类干细胞） 裸鼠皮下及原位异种移植瘤模型
重点核对
合成ITE以10 μM每8小时补充处理 色氨酸缺乏培养基F10（0.6 mg/L）与DMEM（16 mg/L）对比 AhR shRNA敲低及Flag-AHR过表达验证 AHRE1突变体报告基因实验 裸鼠皮下接种U87细胞后瘤内注射ITE 80 mg/mL 5μl每日连续3天
摘要
芳香烃受体（AhR）是一种配体激活的转录因子，响应环境毒物，日益被认为是胚胎发育和肿瘤发生中的关键因素。本文展示多种作为内源性AhR配体的色氨酸衍生物可影响主多能性因子Oct4的转录水平。其中，ITE增强AhR与Oct4启动子的结合并抑制其转录。通过色氨酸剥夺或低氧降低癌细胞中内源性ITE水平导致Oct4升高，可通过给予合成ITE逆转。因此，合成ITE诱导类干细胞癌细胞分化并在皮下和原位异种移植肿瘤模型中降低其致瘤潜力。因此，我们的结果揭示了色氨酸衍生物和AhR信号通路在调控癌细胞干性中的作用，并开辟了靶向类干细胞癌细胞的新治疗途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 内源性或天然AhR配体（色氨酸衍生物）是否调控正常干细胞或类干细胞癌细胞中Oct4的表达及其机制。
- 核心机制
- ITE激活AhR使其结合POU5F1启动子AHRE1 motif，抑制Oct4转录；色氨酸剥夺或低氧降低内源性ITE导致Oct4去抑制而升高。
- 主要证据
- EMSA和ChIP证实AhR结合POU5F1启动子AHRE1；AHRE1突变取消ITE抑制作用；AhR敲低消除ITE效应；肿瘤球及多种异种移植瘤模型中ITE降低Oct4并抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 揭示色氨酸衍生物及AhR通路调控癌细胞干性的新作用，为靶向类干细胞癌细胞提供新治疗途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
AhR直接结合POU5F1启动子验证
确定AhR是否直接结合POU5F1启动子AHRE motif
生物信息学预测AHRE；EMSA检测生物素标记探针与U87核提取物结合；ChIP验证Flag-AhR与POU5F1启动子结合
ITE调控Oct4转录的机制验证
验证ITE通过AhR和AHRE1抑制POU5F1转录
不同色氨酸浓度培养基培养；合成ITE、Kyn、Trp、aTrp处理；HPLC检测内源性ITE；AHRE突变体报告基因；AhR敲低和过表达；EMSA和ChIP检测ITE依赖性结合
ITE抑制低氧诱导的Oct4升高
探究低氧条件下内源性ITE变化及ITE对Oct4的调控
U87细胞在1% O2低氧条件下培养，HPLC检测内源性ITE，qRT-PCR检测POU5F1，补充ITE或色氨酸观察逆转
ITE诱导类干细胞癌细胞分化
验证ITE对肿瘤球中Oct4表达及干性的影响
U87肿瘤球形成实验；ITE处理检测POU5F1 mRNA和Oct4蛋白及Oct4-pT235；AhR siRNA联合Oct4过表达肿瘤球形成实验；DNA微阵列分析
体内验证ITE抗肿瘤效果
在体内验证ITE对Oct4表达和肿瘤生长的影响
U87皮下异种移植瘤瘤内注射ITE 3天；U87皮下瘤腹腔注射ITE 80 mg/kg每日18天；HepG2皮下瘤；HCCLM3-RFP原位肝移植瘤；LNCap皮下瘤剂量依赖实验；ChIP检测肿瘤组织AhR结合
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子结合与机制
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹 | 抗Oct4单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 |
| 抗Oct4多克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | |
| 抗Oct4-pT235抗体 | GenScript | 134164-1 | |
| 抗AhR单克隆抗体 | Thermo Scientific | RPT1 | |
| ChIP | 蛋白A/G琼脂糖珠 | Thermo Scientific | 20421 |
| 免疫印迹 | 抗E-cadherin抗体 | Abcam | ab1416 |
| 抗CK19抗体 | Abcam | ab52625 | |
| 抗Akt-pT308抗体 | Cell Signaling Technology | 2965 | |
| 抗Akt-pS473抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗pan Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9614L | |
| 抗CD44抗体 | Cell Signaling Technology | 3570S | |
| 过氧化物酶标记抗小鼠二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 过氧化物酶标记抗兔二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 抗生物素抗体 | Cell Signaling Technology | 7075 | |
| ChIP | 磁珠偶联小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 5873 |
| 免疫印迹 | 生物素化蛋白梯检测试剂盒 | Cell Signaling Technology | 7727 |
| 抗GAPDH（HRP标记） | GenScript | A00192 | |
| 抗GAPDH | Beyotime Institute of Biotechnology | AG019 | |
| 细胞培养 | 表皮生长因子 | Sigma-Aldrich | E5036 |
| 白血病抑制因子 | Sigma-Aldrich | L5283 | |
| ChIP | 抗Flag M2磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 |
| 细胞分化处理 | 视黄酸 | Sigma-Aldrich | R2625 |
| 药物处理 | 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D5879 |
| 细胞培养 | L-色氨酸 | Sigma-Aldrich | 93659 |
| L-犬尿氨酸 | Sigma-Aldrich | K8625 | |
| RNA提取 | 人总RNA调查面板 | Life Technologies | AM6000 |
| 细胞培养 | B-27无维生素A添加剂 | Life Technologies | 12587-010 |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Life Technologies | PHG0266 | |
| 免疫荧光 | Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Life Technologies | 15596-026 |
| 细胞处理 | Akt抑制剂Akti-1/2 | Calbiochem | 124018 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Invitrogen | 21063-029 |
| 胎牛血清 | GIBCO | 10099 | |
| 胎牛血清 | Pufei | 1101-500 | |
| Ham F12营养混合物 | Hyclone | 11765 | |
| Ham F10营养混合物 | Hyclone | 31550 | |
| DMEM/F12培养基 | Corning | R10-092-CV | |
| 报告基因实验 | pEASY载体 | TransGen Biotech | CT111-01 |
| pGL4.10载体 | Addgene | E6651 | |
| 转染 | SuperFectin II DNA转染试剂 | Shanghai Pufei Biotech | 2102-100 |
| EMSA | LightShift化学发光EMSA试剂盒 | Thermo | 20148 |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| ChIP | PCR纯化试剂盒 | Axygen | AP-PCR-50 |
| qRT-PCR | Platinum SYBR Green qPCR预混液 | Invitrogen | 11733-038 |
| PrimeScript逆转录试剂盒 | TaKaRa | RR037A | |
| 免疫印迹 | 裂解缓冲液 | Cell Signaling Technology | 9803 |
| 完全蛋白酶抑制剂混合物 | Santa Cruz Biotechnology | sc-29130 | |
| 磷酸酶抑制剂PhosSTOP | Roche | 04906845001 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo | 23227 | |
| Western化学发光HRP底物 | Millipore | WBKLS0100 | |
| 细胞增殖检测 | 细胞增殖试剂盒I（MTT） | Roche | 11465007001 |
| DNA微阵列 | GeneChip IVT表达试剂盒 | Affymetrix | 901229 |
| GeneChip杂交、洗涤和染色试剂盒 | Affymetrix | 900720 | |
| 免疫荧光 | 甲醛 | Sigma | F8775-25ML |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A9418 | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Sigma | AL-118 |
| 慢病毒包装 | pMD2.G包装质粒 | Addgene | 12259 |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| 慢病毒载体构建 | pLKO.1-TRC载体 | Addgene | 10878 |
| 细胞培养 | 青霉素/链霉素 | -- | -- |
| 神经干细胞培养基 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与色氨酸浓度 | DMEM含16 mg/L L-色氨酸，F12含2.04 mg/L，F10含0.6 mg/L；血清批次GIBCO 10099或Pufei 1101-500 阅读提示：Methods中Cell culture and treatment小节 |
| ITE处理 | 合成ITE浓度10 μM，每8小时补充一次；长期处理时常规过量添加 阅读提示：Results中Figure 2相关段落及Figure 2图注 |
| AhR敲低与过表达 | AHR shRNA或Flag-AHR慢病毒感染3天，MOI估计0.5-2 阅读提示：Methods中Lentiviral vector construction and viral infection小节 |
| 报告基因与AHRE突变 | phOCT4-EGFP报告基因含正常或突变AHRE1/2/3；ITE 10 μM处理24小时 阅读提示：Methods中phOCT4-EGFP reporter assays小节及Figure 2d图注 |
| 肿瘤球形成实验 | U87细胞30,000 cells/ml接种，NSC培养基含EGF 20 ng/ml、bFGF 20 ng/ml、LIF 10 ng/ml，培养3-5天；ITE 10 μM每8小时补充72小时 阅读提示：Methods中Cell culture and treatment及U87 tumour sphere growth and transfection小节 |
| 体内异种移植实验 | BALB/c裸鼠雌性3-4周龄；U87细胞2.5×10^6皮下接种；瘤内注射5 μl 80 mg/mL ITE每日连续3天或腹腔注射80 mg/kg每日18-33天；每组4-13只 阅读提示：Methods中Mouse xenograft tumour models小节及Figure 4图注 |
| ChIP实验 | U87细胞2×10^7-5×10^7，1%甲醛交联10分钟，超声至300-800 bp；5 μg兔抗AhR或50 μl anti-Flag M2磁珠；qPCR三重复三次独立实验 阅读提示：Methods中Chromatin immunoprecipitation小节及Supplementary Table 1引物 |