建立GSK3β缺失或敲低细胞模型
验证GSK3β在TLR3介导的细胞因子产生中的作用。
构建GSK3β shRNA稳定转染的RAW264.7细胞，使用Gsk3b-/- MEFs及GSK3β siRNA转染的BMDMs。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
TRAF6对糖原合成酶激酶3β的泛素化调控TLR3介导的促炎细胞因子产生
Glycogen synthase kinase 3β ubiquitination by TRAF6 regulates TLR3-mediated pro-inflammatory cytokine production.
实验完整度
高采用RAW264.7、BMDM、MEF及Traf6-/-细胞等多模型，结合敲低/过表达、抑制剂、免疫共沉淀、体内外泛素化及位点突变等功能与机制验证。
主要模型
RAW264.7巨噬细胞系（对照或GSK3β shRNA稳定转染） 小鼠原代骨髓来源巨噬细胞（BMDM） Gsk3b+/+与Gsk3b-/-小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） Traf6+/+与Traf6-/- 3T3细胞
重点核对
poly I:C刺激浓度10 μg/ml及处理时间（1 h、20 h或图中标注） SB216763使用浓度10 μM，预处理1 h MEFs中回补GSK3β WT、GSK3α或GSK3β K85A/K183R突变体 GSK3β K183R突变对TRAF6介导泛素化的抵抗及对细胞因子产生的影响 TRAF6（C70A）催化失活突变体对GSK3β泛素化的作用
摘要
TRAF6对于多种TLR介导的信号通路中炎性细胞因子的产生至关重要。然而，TRAF6如何调控TLR3反应尚知之甚少。本研究表明GSK3β与TRAF6相互作用并正向调控TLR3介导的信号传导。抑制GSK3β表达或其激酶活性可显著减少炎性细胞因子的产生及c-Fos的诱导，同时降低ERK和p38磷酸化。GSK3β在TLR3配体poly I:C依赖的方式下与TRAF6物理结合。TRAF6被确定为GSK3β的直接E3连接酶，且TRAF6介导的GSK3β泛素化对于poly I:C依赖的细胞因子产生至关重要，其通过促进TLR3衔接蛋白TRIF组装的信号复合体实现。GSK3β是调控细胞代谢、迁移、增殖和存活的分子枢纽。本文表明GSK3β通过促进TLR3（病毒感染传感器）下游信号平台的组装来调控炎性细胞因子的产生。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- GSK3β如何调控TLR3介导的促炎细胞因子产生，以及TRAF6在此过程中的作用机制。
- 核心机制
- TRAF6作为E3泛素连接酶催化GSK3β K63链泛素化（关键位点K183），泛素化的GSK3β促进TRIF–TRAF6–TAK1复合体组装，进而激活ERK和p38并诱导c-Fos，最终促进促炎细胞因子产生。
- 主要证据
- 在RAW264.7、BMDM和Gsk3b-/- MEFs中，GSK3β缺失或抑制降低poly I:C诱导的IL-6、TNF-α、IL-10及c-Fos表达和ERK/p38磷酸化；免疫共沉淀显示GSK3β与TRAF6、TAK1形成复合体；体内外泛素化实验证明TRAF6介导GSK3β K63泛素化，K183R突变削弱细胞因子产生。
- 研究意义
- 揭示了GSK3β在TLR3–TRIF信号通路中的新调控机制，为理解炎症和抗病毒反应的复杂分子机制提供了依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测TLR3诱导的细胞因子和信号通路变化
明确GSK3β对TLR3下游细胞因子及MAPK/NF-κB通路的影响。
poly I:C刺激后，用real-time PCR、ELISA和western blot检测细胞因子mRNA/蛋白及ERK、p38、JNK、NF-κB p65磷酸化。
验证GSK3β与TRAF6/TAK1的相互作用及复合体形成
探究GSK3β调控TLR3信号的分子机制。
免疫共沉淀检测GSK3β与TRAF6、TAK1、TRIF等的结合；TLR3免疫沉淀检测信号复合体组装；GST pull-down和质粒转染验证三元复合体。
确定TRAF6对GSK3β的泛素化及关键位点
验证TRAF6为GSK3β的E3连接酶并鉴定泛素化位点。
体内外泛素化实验、突变体（K85R、K86R、K91R、K183R）分析、质谱鉴定修饰位点。
验证GSK3β泛素化对复合体形成和细胞因子产生的影响
明确K183泛素化在TLR3信号中的功能重要性。
回补GSK3β WT或K183R突变体至Gsk3b-/- MEFs或HEK293-TLR3细胞，检测细胞因子mRNA、c-Fos及复合体组装。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| 青霉素 | Hyclone | -- | |
| 链霉素 | Hyclone | -- | |
| 重组人巨噬细胞集落刺激因子 | R&D Systems | -- | |
| 嘌呤霉素 | Sigma | -- | |
| 质粒转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 药物处理 | 聚肌胞苷酸 | Sigma | -- |
| SB216763 | Sigma | -- | |
| BAY 11-7085 | Sigma | -- | |
| PD98059 | Sigma | -- | |
| SB203580 | Sigma | -- | |
| Western blot | 磷酸化GSK3α/β (S21/S9)抗体 | Cell Signaling Technology | 9331 |
| 磷酸化ERK (T202/Y204)抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 磷酸化JNK (T183/185)抗体 | Cell Signaling Technology | 9251 | |
| 磷酸化p38 (T180/Y182)抗体 | Cell Signaling Technology | 9215 | |
| 磷酸化p65 (S536)抗体 | Cell Signaling Technology | 3031 | |
| GSK3β抗体 | Cell Signaling Technology | 9315 | |
| TAK1抗体 | Cell Signaling Technology | 4505 | |
| ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9258 | |
| p38抗体 | Cell Signaling Technology | 8690 | |
| p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| ATF2抗体 | Cell Signaling Technology | 9226 | |
| c-Jun抗体 | Cell Signaling Technology | 9165 | |
| TRAF6抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7221 | |
| c-Fos抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7202 | |
| HA抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7392 | |
| Myc抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| GST抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-138 | |
| TBP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-204 | |
| 泛素抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8017 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-87778 | |
| α-微管蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58666 | |
| GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-87724 | |
| GSK3α/β抗体 | Invitrogen | 44-610 | |
| RIP1抗体 | BD Pharmingen | 610459 | |
| Flag抗体 | Sigma | F3156 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A琼脂糖 | Millipore | -- |
| Western blot | 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- |
| ELISA | 小鼠IL-6、TNF-α和IL-10 ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| RNA提取与逆转录 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录 | Superscript cDNA合成试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 实时PCR | KAPA SYBR green FAST qPCR试剂盒 | Kapa Biosystems | -- |
| ABI 7300实时PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 体外泛素化 | GSK3β蛋白 | Invitrogen | PV3365 |
| 泛素化试剂盒 | Enzo Life Sciences | -- | |
| 体外泛素化检测 | 辣根过氧化物酶标记链霉亲和素 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| GST pull-down | 谷胱甘肽-琼脂糖4B | GE Healthcare | -- |
| 荧光素酶实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| 免疫沉淀 | 抗HA琼脂糖 | Thermo scientific | -- |
| 细胞转染 | Microporator MP-100电转仪 | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GSK3β敲低/缺失模型 | RAW264.7稳定转染GSK3β shRNA序列（5′-CATGAAAGTTAGCAGAGATAA-3′），筛选使用4 μg/ml嘌呤霉素2周；BMDMs转染GSK3β siRNA（5′-ACACGAAAGTGATTGGAAATT-3′）20 nM 36 h 阅读提示：Methods: Cell culture and transfection；Figure 1a；Supplementary Fig. 3 |
| poly I:C刺激与细胞因子检测 | poly I:C浓度10 μg/ml；mRNA检测刺激1 h，蛋白检测刺激20 h；real-time PCR以β-actin归一化；ELISA检测培养上清 阅读提示：Figure 1a,d；Methods: Real-time PCR analysis, Enzyme-linked immunosorbent assay |
| 抑制剂处理 | SB216763 10 μM预处理1 h；PD98059 10 μM、SB203580 10 μM、SP600125 25 μM、BAY 11-7085 10 μM均预处理1 h 阅读提示：Figure 1d；Figure 3e-h；Methods: Reagents and antibodies |
| 信号复合体免疫共沉淀 | poly I:C刺激10 min；使用抗TLR3抗体进行免疫沉淀；检测TRIF、RIP1、TRAF6、TAK1、TAB1、TAB2、GSK3β 阅读提示：Figure 4；Methods: Immunoprecipitation and western blot analysis |
| 泛素化位点与功能验证 | GSK3β K183R突变体；TRAF6 C70A突变体；体外泛素化体系含5 nM Flag-TRAF6、1 μM GSK3β、100 nM His-E1、1 μM His-E2、2.5 μM Bt-Ub 阅读提示：Figure 6c,f；Methods: In vitro ubiquitination assay；Supplementary Table 1 |