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        KLF5和Fli1的同时下调是系统性硬化症的关键特征

        Simultaneous downregulation of KLF5 and Fli1 is a key feature underlying systemic sclerosis.

        作者信息Shinji Noda, Yoshihide Asano, Satoshi Nishimura, Takashi Taniguchi, Katsuhito Fujiu, Ichiro Manabe, Kouki Nakamura, Takashi Yamashita, Ryosuke Saigusa, Kaname Akamata, Takehiro Takahashi, Yohei Ichimura, Tetsuo Toyama, Daisuke Tsuruta, Maria Trojanowska, Ryozo Nagai, Shinichi Sato
        PMID25504335
        期刊Nat Commun
        发布时间2014-12-12
        DOI10.1038/ncomms6797
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        含人SSc皮肤/成纤维细胞、多种小鼠模型（BLM、Tsk/+、条件敲除、双杂合），并有功能与机制验证

        主要模型

        SSc患者皮肤成纤维细胞 正常皮肤成纤维细胞 Klf5+/−;Fli1+/−双杂合小鼠 BLM诱导的Klf5+/−小鼠皮肤纤维化模型

        重点核对

        SSc患者与健康对照皮肤成纤维细胞中KLF5表达及表观遗传修饰（5-aza 5 μM、TSA 2 μM处理48小时） BLM皮下注射（300 μg隔天一次，3周）诱导Klf5+/−小鼠皮肤纤维化 KLF5与Fli1对CTGF启动子KBE1的结合及协同转录抑制（ChIP、荧光素酶报告基因） Klf5+/−;Fli1+/−小鼠皮肤、肺纤维化与血管病变的组织学及影像学评估 Klf5+/−;Fli1+/−小鼠B细胞CD19表达、IL-6产生及自身抗体检测

        摘要

        系统性硬化症（SSc）表现为纤维化、血管病变和免疫失调。迄今为止，支撑这些病理事件的统一假说仍不清楚。鉴于SSc是由遗传和环境因素共同引起的多因素疾病，我们聚焦于两种调节纤维化反应且在SSc真皮成纤维细胞中被表观遗传抑制的转录因子：Friend白血病整合1（Fli1）和Krüppel样因子5（KLF5）。除了Fli1沉默依赖的胶原诱导外，同时敲低Fli1和KLF5协同增强结缔组织生长因子的表达。值得注意的是，模拟SSc皮肤表观遗传表型的Klf5和Fli1双杂合缺陷小鼠自发重现了SSc的全部三个特征，包括皮肤和肺的纤维化和血管病变、B细胞活化以及自身抗体产生。这些研究表明，Fli1和KLF5的表观遗传下调是触发SSc致病三联征的核心事件。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        SSc的纤维化、血管病变和免疫失调三大病理特征是否由统一的分子事件触发？
        核心机制
        Fli1和KLF5在SSc成纤维细胞中表观遗传下调，二者形成转录复合物结合CTGF启动子KBE1协同抑制CTGF转录；同时下调导致CTGF过表达及I型胶原诱导，进而触发SSc三大表现。
        主要证据
        人SSc成纤维细胞中KLF5表观遗传抑制；KLF5与Fli1协同抑制CTGF转录的启动子结合与报告基因实验；Klf5+/−;Fli1+/−小鼠自发出现皮肤和肺纤维化、血管病变、B细胞活化及自身抗体产生。
        研究意义
        提出Fli1和KLF5同时下调是触发SSc致病三联征的核心事件，为理解SSc发病机制提供新概念，并提示表观遗传调控KLF5/Fli1通路可能具有治疗潜力。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        SSc成纤维细胞中KLF5表观遗传下调的验证

        验证KLF5在SSc成纤维细胞中是否表达降低及其表观遗传机制

        用免疫组化、免疫印迹和qRT-PCR检测人皮肤样本和培养真皮成纤维细胞中KLF5表达；用5-aza-2′-deoxycytidine和trichostatin A处理成纤维细胞；用ChIP检测KLF5启动子组蛋白乙酰化；用亚硫酸氢盐测序检测KLF5启动子CpG岛甲基化。

        2

        KLF5杂合缺陷对皮肤纤维化的体内影响

        评估KLF5缺陷在体内是否促进皮肤纤维化

        用BLM诱导Klf5+/−小鼠皮肤纤维化，检测真皮厚度、肌成纤维细胞和CTGF阳性成纤维细胞数、Ctgf和Col1a2 mRNA；将Tsk/+与Klf5+/−杂交；用Klf5fl/fl;Col1a2-Cre/ERT小鼠他莫昔芬诱导成纤维细胞特异性Klf5敲除。

        3

        KLF5转录抑制CTGF的机制验证

        验证KLF5是否直接结合CTGF启动子并抑制其转录

        用KLF5 siRNA处理人包皮成纤维细胞，检测CTGF mRNA和蛋白；用CTGF启动子报告基因与KLF5过表达或敲低；用ChIP检测KLF5与CTGF启动子结合；突变 putative KLF5结合位点；用寡核苷酸拉下实验验证KBE1结合。

        4

        KLF5与Fli1协同抑制CTGF转录

        验证KLF5与Fli1是否形成复合物协同抑制CTGF

        用免疫共沉淀检测KLF5与Fli1或Ets1的物理相互作用；用ChIP检测Fli1与CTGF启动子结合；共转染KLF5和Fli1表达载体检测CTGF报告基因活性；同时敲低KLF5和FLI1检测CTGF表达。

        5

        KLF5和Fli1同时下调作为SSc分子标志的验证

        验证SSc患者真皮成纤维细胞中KLF5和Fli1是否同时下调

        用免疫组化检测不同自身抗体类型SSc患者及其他纤维化疾病患者皮肤中KLF5和Fli1表达；用qRT-PCR检测SSc患者成纤维细胞中KLF5和Fli1 mRNA相关性。

        6

        Klf5+/−;Fli1+/−小鼠自发SSc样表型的表征

        验证双杂合缺陷小鼠是否自发重现SSc三大特征

        检测3月龄Klf5+/−;Fli1+/−小鼠皮肤厚度、胶原含量、纤维化标志基因、肌成纤维细胞和CTGF阳性细胞；检测TGF-β通路活化；用电镜检测胶原原纤维；检测皮肤和肺血管结构、血流速度和缺氧；检测肺纤维化和血管闭塞；检测B细胞浸润、CD19表达、IL-6产生和自身抗体。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        免疫组织化学免疫印迹定量逆转录PCR透射电子显微镜流式细胞术
        验证分子表达变化
        染色质免疫沉淀亚硫酸氢盐测序寡核苷酸拉下实验免疫沉淀
        验证机制链路
        荧光素酶报告基因实验定点突变小干扰RNA敲低
        评估体内效果
        博来霉素诱导的皮肤纤维化模型多光子活体成像酶联免疫吸附实验B细胞分离与刺激
        数据分析与统计
        Mann-Whitney U检验单因素方差分析及Bonferroni事后检验双尾非配对t检验Spearman相关分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        表观遗传抑制剂处理5-氮杂-2′-脱氧胞苷----
        曲古抑菌素A----
        胶原含量测定QuickZyme总胶原蛋白检测试剂盒QuickZymeQZBtotcol
        ELISA小鼠抗核抗体ELISA试剂盒Alpha Diagnostic International5210
        小鼠抗拓扑异构酶I抗体ELISA试剂盒Alpha Diagnostic International6110
        小鼠总IgG ELISA试剂盒eBioscience88-50400
        小鼠总IgM ELISA试剂盒eBioscience88-50470
        小鼠总IgA ELISA试剂盒eBioscience88-50450
        小鼠IL-6 ELISA试剂盒R & D SystemsM6000B
        免疫组织化学抗KLF5抗体（KM1784）--KM1784
        体外实验抗KLF5抗体（KM3918）--KM3918
        免疫印迹抗CTGF抗体Santa Cruz Biotechnologysc-14939
        抗Fli1抗体Santa Cruz Biotechnologysc-356
        抗Ets1抗体Santa Cruz Biotechnologysc-111
        抗α-SMA抗体Sigma-AldrichA2547
        抗β-肌动蛋白抗体Sigma-AldrichA5441
        免疫组织化学抗Fli1抗体R & DAF6474
        染色质免疫沉淀抗乙酰化组蛋白H3抗体EMD Millipore Corporation06-599
        抗乙酰化组蛋白H4抗体EMD Millipore Corporation06-866
        免疫荧光抗前表面活性蛋白C抗体EMD Millipore CorporationAB3786
        免疫组织化学抗血管性血友病因子抗体EMD Millipore CorporationAB7356
        免疫印迹抗I型胶原抗体Southern Biotech1310-01
        免疫组织化学抗增殖细胞核抗原抗体Abcamab18197
        免疫印迹抗Smad3抗体Cell Signaling Technology9523
        抗磷酸化Smad3抗体Cell Signaling Technology9520
        抗ERK抗体Cell Signaling Technology4695
        抗磷酸化ERK抗体Cell Signaling Technology4370
        抗p38抗体Cell Signaling Technology9212
        抗磷酸化p38抗体Cell Signaling Technology9211
        抗JNK抗体Cell Signaling Technology9258
        抗磷酸化JNK抗体Cell Signaling Technology4671
        免疫组织化学Vectastain ABC试剂盒Vector Laboratories--
        免疫荧光FITC标记抗兔抗体Santa Cruzsc-2090
        Alexa Fluor 555标记抗山羊抗体Life technologiesA21432
        抗核抗体检测FITC标记抗小鼠IgGMilliporeAP308F
        透射电镜JEM-1200EX透射电子显微镜JEOL Ltd.--
        免疫印迹RIPA裂解缓冲液Santa Cruzsc-24948
        HRP标记抗小鼠IgGSanta Cruzsc-2371
        HRP标记抗兔IgGSanta Cruzsc-2955
        HRP标记抗山羊IgGMP Biomedicals55363
        MagicMark XP Western蛋白标准品Life TechnologiesLC5602
        Precision Plus Protein双色标准品Bio-Rad161-0374
        siRNA转染KLF5 siRNA（ON-TARGETplus SMARTpool）Thermo Fisher ScientificL-013571-00-0005
        Fli1 siRNASanta Cruzsc-35384
        对照乱序RNASanta Cruzsc-37007
        HiPerFect转染试剂Qiagen301705
        RNA提取RNeasy Mini试剂盒Qiagen74104
        RNeasy Fibrous Tissue Mini试剂盒Qiagen74704
        逆转录iScript cDNA合成试剂盒Bio-Rad170-8891
        qRT-PCRFast SYBR Green PCR预混液Life technologies4385617
        TaqMan Universal PCR预混液Life technologies4304437
        ABI prism 7000实时PCR仪Life technologies--
        染色质免疫沉淀EpiQuik ChIP试剂盒EpigentekP-2002
        DNA提取NucleoSpin组织DNA提取试剂盒Macherey-Nagel740952
        亚硫酸氢盐修饰MethylEasy Xceed快速DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒Human Genetic SignaturesME002
        亚硫酸氢盐PCREpiTaq HS DNA聚合酶Takara BioR110A
        克隆Mighty TA克隆试剂盒Takara Bio6028
        大肠杆菌HST08Takara Bio9128
        定点突变QuikChange II定点突变试剂盒Agilent Technologies200523
        质粒扩增大肠杆菌DH5αTakara Bio9057
        质粒提取质粒Midi试剂盒Qiagen12145
        荧光素酶报告基因实验X-tremeGENE 9 DNA转染试剂Roche06365787001
        Lipofectamine 2000转染试剂Life technologies11668019
        AB-2200化学发光仪ATTO--
        双荧光素酶报告基因系统PromegaE1910
        海肾荧光素酶PromegaE2241
        免疫沉淀Pierce Crosslink免疫沉淀试剂盒Thermo Fisher Scientific26147
        血管网络可视化FITC标记葡聚糖Sigma-AldrichFD2000S
        B细胞分选CD19阳性选择MACS磁珠Miltenyi Biotec130-052-201
        B细胞刺激脂多糖Sigma-AldrichL5293
        抗CD40抗体BioLegend102810
        活体成像德克萨斯红标记葡聚糖Life technologiesD1830
        Hoechst 33342染料Life technologiesH1399
        钛蓝宝石激光器（Visio II）Coherent--
        Nikon A1R-MP多光子成像系统Nikon--
        缺氧检测缺氧探针（LOX-1）SCIVAX--
        FITC标记葡聚糖SigmaFD150
        Hoechst 33342染料Invitrogen--
        流式细胞术2型胶原酶WorthingtonLS004176
        红细胞裂解缓冲液BD Biosciences555899
        抗CD16/CD32抗体BD Biosciences553141
        抗小鼠CD45R抗体（FITC）BD Biosciences553088
        抗小鼠CD19抗体（PE/Cy7）Biolegend115519
        碘化丙啶Life technologiesP3566
        FACSCanto II流式细胞仪BD Biosciences--

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        SSc成纤维细胞表观遗传分析
        SSc患者皮肤样本来源（前臂，8例dcSSc，病程<2年）、对照来源（性别部位匹配8例健康供者）、细胞代次（3-6代）、5-aza浓度5 μM和TSA浓度2 μM处理48小时
        阅读提示：Methods 'Patients and fibroblast cultures'及Figure 1 legend
        BLM诱导皮肤纤维化模型
        小鼠品系（Klf5+/−、WT，C57Bl/6J背景）、性别年龄（6周龄雌性）、BLM剂量300 μg隔天皮下注射3周、每组小鼠数（n=3-4）
        阅读提示：Methods 'Animal models'及Figure 2 legend
        KLF5/Fli1协同抑制CTGF转录的机制实验
        细胞类型（人包皮成纤维细胞）、siRNA转染24小时、TGF-β1浓度2 ng/ml刺激24小时、报告基因检测转染后30小时、ChIP抗体和引物
        阅读提示：Methods 'Small interfering RNA'、'Chromatin immunoprecipitation assay'、'Reporter gene assay'及Figure 3 legend
        Klf5+/−;Fli1+/−小鼠表型分析
        小鼠年龄（3月龄雄性用于皮肤，2-8月龄用于肺和血管）、每组样本量（n=4-9）、组织学评分盲法、电镜测量500根原纤维
        阅读提示：Methods 'Animal models'、'Immunohistochemistry'、'Transmission electron microscopy'及Figure 5-8 legends
        B细胞功能与自身免疫检测
        B细胞分选方法（CD19 MACS磁珠）、刺激条件（LPS 5 μg/ml和/或anti-CD40 10 μg/ml，48小时）、ELISA试剂盒和血清稀释度、流式抗体稀释度1/100
        阅读提示：Methods 'B cell sorting and stimulation'、'Enzyme-linked immunosorbent assay'、'Flow cytometry'及Figure 8 legend

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