检测巨噬细胞中RasGRP家族表达及TLR刺激后的变化
确定巨噬细胞中优势表达的RasGRP成员及其对TLR刺激的响应。
用Q-PCR和Western blot检测小鼠腹腔巨噬细胞、骨髓来源巨噬细胞、PMA处理的THP-1细胞和人MDM中RasGRP1-4表达；并用LPS、Poly(I:C)、CpG ODN或病毒感染刺激后检测RasGRP3 mRNA和蛋白变化。
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RasGRP3通过激活Rap1小GTP酶限制巨噬细胞中Toll样受体触发的炎症反应
RasGRP3 limits Toll-like receptor-triggered inflammatory response in macrophages by activating Rap1 small GTPase.
实验完整度
高包含小鼠原代巨噬细胞、人巨噬细胞、CRISPR敲除细胞系、转基因小鼠及两种疾病模型，并有功能与机制验证。
主要模型
小鼠腹腔巨噬细胞和骨髓来源巨噬细胞 人THP-1细胞和人单核细胞来源巨噬细胞（MDM） RAW264.7巨噬细胞（野生型及CRISPR-Cas9 RasGRP3缺陷株） RasGRP3或RasGRP3-T133A转基因小鼠及DSS结肠炎和CIA模型
重点核对
TLR激动剂剂量：LPS 1 ng/ml或100 ng/ml、Poly(I:C) 2.5 μg/ml或10 μg/ml、CpG ODN 0.5 μM或5 μM RasGRP3敲低或敲除效率：siRNA转染48 h后Q-PCR和Western blot验证；CRISPR敲除经测序和Western blot验证 Rap1a或Rap1b敲低：siRNA转染48 h后验证，检测Rap1-GTP水平及IL-6产生 体内TLR刺激：LPS 1、10、200 μg/kg或20 mg/kg，Poly(I:C)和CpG ODN低剂量腹腔注射，2.5 h后测血清IL-6 DSS结肠炎：2.5% DSS饮水7天，第10天评估结肠病理和血清IL-6；CIA：鸡II型胶原100 μg免疫，第0天和第21天加强
摘要
宿主免疫细胞可通过模式识别受体检测并破坏入侵病原体。小Rap GTP酶作为保守的分子开关，将细胞外信号与多种细胞反应偶联，但其作为Toll样受体（TLR）信号调节因子的作用尚未完全阐明。本文报道Ras鸟嘌呤核苷酸释放蛋白3（RasGRP3）是一种激活Ras和Rap1的鸟嘌呤核苷酸交换因子，在低水平TLR激动剂激活时通过激活Rap1限制巨噬细胞中促炎细胞因子（尤其是IL-6）的产生。我们证明，RasGRP3是巨噬细胞中RasGRPs的优势成员，可减弱TLR3/4/9诱导的IL-6产生，并缓解葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎和胶原诱导的关节炎。在通过CRISPR-Cas9基因组编辑获得的RasGRP3缺陷RAW264.7细胞中，TLR3/4/9诱导的Rap1激活受到抑制，而ERK1/2激活增强。我们的研究表明，RasGRP3在低强度病原体感染时通过激活Rap1限制炎症反应，设定阈值以防止过度炎症反应。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RasGRPs是否以及如何调控巨噬细胞对TLR激活的炎症反应，特别是低强度感染时的阈值设定。
- 核心机制
- RasGRP3通过激活Rap1（而非Ras）抑制TLR诱导的ERK1/2活化，并可能通过影响Akt磷酸化状态负向调控IL-6等促炎细胞因子的产生。
- 主要证据
- 在小鼠原代巨噬细胞、人巨噬细胞和RasGRP3缺陷RAW264.7细胞中，RasGRP3缺失导致Rap1-GTP降低、ERK1/2活化增强及IL-6等产生增加；RasGRP3转基因小鼠在低剂量TLR激动剂下血清IL-6降低，并减轻DSS结肠炎和CIA。
- 研究意义
- RasGRP3在低水平病原体感染时通过Rap1设定巨噬细胞激活阈值，防止过度炎症反应，提示其可能在炎症性疾病中发挥保护作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
敲低RasGRP3检测对TLR诱导的促炎细胞因子产生的影响
验证RasGRP3对巨噬细胞TLR反应中促炎细胞因子产生的调控作用。
在小鼠腹腔巨噬细胞、THP-1细胞和人MDM中转染RasGRP3特异性siRNA，用低剂量TLR激动剂刺激后，通过Q-PCR和ELISA检测IL-6、TNFα、IL-1β和iNOS表达。
过表达RasGRP3及其突变体检测对IL-6产生的影响
从功能获得角度验证RasGRP3对TLR诱导IL-6产生的抑制作用及关键磷酸化位点的作用。
在RAW264.7细胞中稳定过表达Flag-RasGRP3，在转基因小鼠腹腔巨噬细胞中过表达RasGRP3或RasGRP3-T133A，用低剂量TLR激动剂刺激后检测IL-6 mRNA和蛋白；并用PKC抑制剂GÖ-6983处理检测RasGRP3 Thr133磷酸化。
检测RasGRP3对Rap1和Ras活性的影响
确定RasGRP3在TLR信号中激活的小GTP酶类型。
在RasGRP3敲低的腹腔巨噬细胞或RasGRP3缺陷RAW264.7细胞中，用TLR激动剂刺激后，通过Ras/Rap1活化检测试剂盒检测GTP结合的Rap1和Ras水平。
验证Rap1a在RasGRP3下游调控IL-6产生中的作用
确认RasGRP3是否通过Rap1a调控TLR诱导的IL-6产生。
在腹腔巨噬细胞中敲低Rap1a或Rap1b，或在RasGRP3转基因小鼠骨髓来源巨噬细胞中敲低Rap1a，用低剂量LPS刺激后检测IL-6 mRNA和蛋白。
检测RasGRP3对TLR下游信号通路活化的影响
阐明RasGRP3调控IL-6产生的信号通路机制。
在RasGRP3敲低的腹腔巨噬细胞或RasGRP3缺陷RAW264.7细胞中，用低剂量TLR激动剂刺激后，通过Western blot检测ERK1/2、JNK1/2、p38、IKKα/β-IκBα和Akt的磷酸化；并用MEK/ERK抑制剂PD98059或PI3K抑制剂Wortmannin预处理验证。
体内验证RasGRP3对TLR诱导IL-6产生的影响
在体内水平验证RasGRP3对TLR反应中IL-6产生的负向调控作用。
给野生型、RasGRP3或RasGRP3-T133A转基因小鼠腹腔注射不同剂量TLR激动剂，2.5 h后检测血清IL-6；并通过骨髓移植和转基因巨噬细胞过继转移实验验证巨噬细胞内在机制。
评估RasGRP3对DSS诱导结肠炎和胶原诱导关节炎的影响
探究RasGRP3在炎症性疾病模型中的病理意义。
将野生型、RasGRP3或RasGRP3-T133A转基因巨噬细胞过继转移至辐照野生型小鼠，随后给予2.5% DSS饮水7天，评估体重、结肠病理和血清IL-6；或直接用转基因小鼠建立CIA模型，评估关节炎临床评分、病理和血清IL-6。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco of Life Technologies | -- |
| 胎牛血清 | Gibco of Life Technologies | -- | |
| 重组巨噬细胞集落刺激因子 | R&D Systems | -- | |
| 磁珠 | Miltenyi Biotec Technology & Trading | -- | |
| 质粒转染 | jetPEI转染试剂 | Polyplus-Transfection Company | -- |
| RNA干扰 | INTERFERin-HTS转染试剂 | Polyplus-Transfection Company | -- |
| TLR刺激 | 脂多糖（0111:B4） | Sigma | -- |
| 聚肌胞苷酸 | Sigma | -- | |
| CpG寡脱氧核苷酸（ODN 2395） | Invivogen | -- | |
| Western blot | Flag标签抗体（ab125243） | Abcam | ab125243 |
| 磷酸化RasGRP3（Thr133）抗体（ab124843） | Abcam | ab124843 | |
| RasGRP1抗体（ab37927） | Abcam | ab37927 | |
| RasGRP2抗体（ab137608） | Abcam | ab137608 | |
| RasGRP4抗体（sc-292930） | Santa Cruz Biotechnology | sc-292930 | |
| RasGRP3抗体（3334） | Cell Signaling Technology | 3334 | |
| ERK1/2抗体（4695） | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 磷酸化ERK1/2（Thr202/Tyr204）抗体（9101） | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| JNK1/2抗体（9252） | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| 磷酸化JNK1/2（Thr183/Tyr185）抗体（4668） | Cell Signaling Technology | 4668 | |
| p38抗体（9212） | Cell Signaling Technology | 9212 | |
| 磷酸化p38（Thr180/Tyr182）抗体（9215） | Cell Signaling Technology | 9215 | |
| IKKα/β抗体（8943） | Cell Signaling Technology | 8943 | |
| 磷酸化IKKα/β（Ser176/180）抗体（2697） | Cell Signaling Technology | 2697 | |
| Akt抗体（9272） | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 磷酸化Akt（Ser473）抗体（4060） | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 磷酸化Akt（Thr307）抗体（9275） | Cell Signaling Technology | 9275 | |
| IκBα抗体（9246） | Cell Signaling Technology | 9246 | |
| 磷酸化IκBα（Ser32/36）抗体（4814） | Cell Signaling Technology | 4814 | |
| β-肌动蛋白抗体（A1987） | Sigma | A1987 | |
| Ras/Rap1活化检测 | Ras活化检测试剂盒 | Merck Millipore | -- |
| Rap1活化检测试剂盒 | Merck Millipore | -- | |
| ELISA | 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 小鼠TNFα ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| 人IL-6 ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| 人TNFα ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| Western blot | Supersignal West Femto最高灵敏度底物 | Pierce | -- |
| BCA蛋白测定试剂盒 | Pierce | -- | |
| 流式分选 | Gallios流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| Q-PCR | MJR Chromo 4连续荧光检测仪 | Bio-Rad | -- |
| Trizol试剂 | Invitrogen | -- | |
| AMV逆转录酶试剂盒 | Promega | -- | |
| 质粒构建 | pcDNA3.1真核表达载体 | Invitrogen | -- |
| Mutanbest定点突变试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| CIA模型 | 鸡II型胶原 | Sigma | -- |
| 完全弗氏佐剂 | Sigma | -- | |
| 不完全弗氏佐剂 | Sigma | -- | |
| DSS结肠炎模型 | 葡聚糖硫酸钠 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 巨噬细胞中RasGRP3表达及TLR刺激后的下调 | 细胞来源（小鼠品系C57BL/6、周龄6-8周）、TLR激动剂剂量（LPS 100 ng/ml、Poly(I:C) 10 μg/ml、CpG ODN 5 μM）、病毒MOI=1、刺激时间点 阅读提示：Methods中Mice and reagents及Cell preparation小节；Figure 1图注 |
| RasGRP3敲低对TLR诱导细胞因子产生的影响 | siRNA转染浓度与方式（文中未明确说明）、敲低效率验证时间（48 h）、TLR激动剂低剂量（LPS 1 ng/ml、Poly(I:C) 2.5 μg/ml、CpG ODN 0.5 μM）、刺激时间、检测方法（Q-PCR/ELISA） 阅读提示：Methods中RNA interference及Measurement of cytokines小节；Figure 2、Figure 3图注 |
| RasGRP3过表达及T133A突变体对IL-6产生的影响 | 转基因小鼠构建策略（CMV启动子驱动Flag标签全长RasGRP3或RasGRP3-T133A）、过表达验证、TLR激动剂剂量（LPS 1 ng/ml、Poly(I:C) 2.5 μg/ml、CpG ODN 0.5 μM）、刺激时间6 h 阅读提示：Methods中Generation of RasGRP3 transgenic mice小节；Figure 4图注；Supplementary Fig. 7 |
| RasGRP3对Rap1和Ras活性的调控 | GTP结合蛋白检测试剂盒（Ras Activation Assay Kit和Rap1 Activation Assay Kit，Merck Millipore）、TLR激动剂剂量（LPS 1 ng/ml、Poly(I:C) 2.5 μg/ml、CpG ODN 0.5 μM）、刺激时间点、GDP/GTPγS对照设置 阅读提示：Methods中Determination of GTP-bound Ras and Rap1 levels小节；Figure 5、Figure 10图注 |
| Rap1a敲低对RasGRP3调控IL-6产生的影响 | Rap1a和Rap1b siRNA序列及转染效率、LPS剂量（1 ng/ml或100 ng/ml）、刺激时间6 h、检测方法（Q-PCR/ELISA） 阅读提示：Methods中RNA interference小节；Figure 5图注 |
| RasGRP3对TLR下游信号通路的影响及抑制剂验证 | TLR激动剂剂量（LPS 1 ng/ml、Poly(I:C) 2.5 μg/ml、CpG ODN 0.5 μM）、刺激时间点、PD98059和Wortmannin浓度（文中未明确说明）及预处理时间30 min、Western blot检测指标 阅读提示：Methods中Western blotting小节；Figure 6图注 |
| 体内TLR反应及巨噬细胞过继转移实验 | TLR激动剂剂量（LPS 1、10、200 μg/kg或20 mg/kg；Poly(I:C)和CpG ODN低剂量）、给药途径（腹腔注射）、取血时间（2.5 h）、小鼠数量（n=5至12）、骨髓移植辐射剂量（2×500 Rads）及细胞转移数量（2×10^6） 阅读提示：Methods中In vivo modulation of TLR response及Irradiation and transgenic macrophage transfer小节；Figure 7图注 |
| DSS诱导结肠炎模型 | DSS浓度2.5%及饮水时间7天、巨噬细胞过继转移时间点（骨髓移植后第8天，转移后第2天给DSS）、体重监测时间点、第10天结肠病理评分标准（0-4分）、每组小鼠数量（n=5至8） 阅读提示：Methods中DSS-induced colitis and colitis histology小节；Figure 8图注 |
| 胶原诱导关节炎（CIA）模型 | 鸡II型胶原剂量100 μg、免疫途径（皮内）、完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂乳化、初次免疫后第21天加强、临床评分标准（0-4分）、观察时间点（第52天和第120天）、每组小鼠数量（n=5） 阅读提示：Methods中Immunization protocols and manipulation of CIA小节；Figure 9图注 |
| CRISPR-Cas9敲除RasGRP3的RAW264.7细胞验证 | gRNA序列（仅第二条有效：5′-GAATCGTGTTACTGATGCACCGA-3′）、单克隆筛选及验证方法（Western blot和DNA测序）、TLR激动剂剂量（LPS 1 ng/ml、Poly(I:C) 2.5 μg/ml、CpG ODN 0.5 μM） 阅读提示：Methods中CRISPR-Cas9-mediated depletion of RasGRP3小节；Figure 10图注 |