计算机筛选PLpro切割位点
在人类病毒蛋白组中寻找PLpro潜在切割位点，确定候选靶蛋白。
从HVIDB数据库筛选109种人类致病病毒，提取CDS翻译为蛋白序列，统计GG、LXGG、VXGG、YXGG四肽基序数量，并比较各病毒蛋白中基序密度。
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SARS-CoV-2通过PLpro介导的EBNA1降解抑制EBV依赖性肿瘤增殖
SARS-CoV-2 inhibits EBV-dependent tumor proliferation through PLpro-mediated degradation of EBNA1
实验完整度
高含体外细胞系、病毒复制子颗粒感染、异种移植小鼠模型及多组生化验证，覆盖功能与机制验证
主要模型
Raji细胞（Burkitt淋巴瘤EBV潜伏感染） C666-1细胞（鼻咽癌EBV潜伏感染） SNU-719细胞（胃癌EBV潜伏感染） BALB/c Nude小鼠Raji细胞皮下移植瘤模型
重点核对
PLpro切割EBNA1的CS4和CS15位点效率最高（荧光素酶报告系统与GFP-CAT系统验证，n=3） PLpro催化突变体C111S、H272A、D286S及抑制剂GRL-0617（50或100 μmol/L，48 h）可阻断EBNA1降解 VRP感染Raji、C666-1、SNU-719细胞后EBNA1蛋白下降、Zta和Rta升高，EBV基因组拷贝数增加 Raji细胞皮下接种1×10^7细胞/只，6周龄雌性BALB/c Nude小鼠，n=5，肿瘤成瘤后瘤内注射VRP或AAV9-PLpro 肿瘤体积和体重记录23天，终点检测EBNA1蛋白、Zta/gp350转录及H&E染色
摘要
宿主内多种病毒的共循环可产生不同于单病毒感染的结果。在COVID-19大流行期间，超过7亿例有记录的SARS-CoV-2感染表明SARS-CoV-2与其他人类病毒频繁共循环。然而，SARS-CoV-2感染如何影响其他病毒感染仍不清楚。在本研究中，我们研究了SARS-CoV-2木瓜蛋白酶样蛋白酶（PLpro）的蛋白水解活性如何影响其他人类病毒的感染。计算机分析在众多病毒蛋白中鉴定了候选PLpro切割位点，生化实验证实PLpro以依赖其蛋白酶活性的方式催化Epstein-Barr病毒（EBV）核抗原1（EBNA1）的降解。异位表达PLpro和SARS-CoV-2感染均降低EBNA1丰度，导致潜伏EBV再激活。鉴于EBNA1在维持EBV相关肿瘤发生中的重要作用，SARS-CoV-2和PLpro介导的EBNA1降解可转化为对EBV驱动肿瘤增殖的抑制作用。这些发现建立了SARS-CoV-2 PLpro破坏EBV潜伏并抑制EBV相关肿瘤发生的分子机制，将EBNA1定位为EBV相关恶性肿瘤的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2感染及其PLpro蛋白酶活性如何影响其他人类病毒（尤其是EBV）的感染与潜伏状态，以及是否影响EBV相关肿瘤增殖。
- 核心机制
- SARS-CoV-2 PLpro进入细胞核，通过其蛋白酶活性在EBNA1的Gly-Gly基序（CS4、CS15）处切割EBNA1，导致EBNA1蛋白降解；EBNA1缺失解除对EBV潜伏的维持，诱导Zta/Rta表达和EBV裂解再激活，进而抑制EBV驱动肿瘤增殖。
- 主要证据
- 计算机筛选109种病毒蛋白组发现EBNA1含最高密度PLpro切割基序；荧光素酶和GFP-CAT报告系统证实CS4/CS15高效切割；PLpro表达或SARS-CoV-2 VRP感染降低EBNA1蛋白并上调Zta/Rta；Raji异种移植瘤中瘤内注射VRP或AAV9-PLpro后肿瘤生长减缓、EBNA1下降、Zta/gp350升高及细胞死亡增加。
- 研究意义
- 揭示SARS-CoV-2 PLpro破坏EBV潜伏并抑制EBV相关肿瘤发生的分子机制，提示EBNA1可作为EBV相关恶性肿瘤的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PLpro切割位点报告系统验证
验证PLpro对EBNA1候选切割位点的切割效率及蛋白酶活性依赖性。
构建荧光素酶报告系统（UB-Luci）和GFP-CAT系统，将EBNA1候选切割位点插入报告蛋白之间，共表达PLpro或催化突变体，检测发光或Western blot切割片段。
PLpro介导EBNA1降解的验证
验证PLpro及nsp3是否降低EBNA1蛋白水平，并确认依赖蛋白酶活性及切割位点。
在HEK293T细胞中共转染EBNA1与nsp3、PLpro或催化突变体，或使用GRL-0617处理，Western blot检测EBNA1蛋白水平；构建EBNA1切割位点突变体验证降解依赖性。
PLpro核定位及与EBNA1相互作用检测
确定PLpro是否进入细胞核并与EBNA1物理结合。
细胞核质分离和免疫荧光检测nsp3/PLpro及其结构域定位；免疫共沉淀检测PLpro结构域与EBNA1的结合。
PLpro诱导潜伏EBV再激活的细胞验证
验证PLpro是否通过降解EBNA1诱导潜伏EBV再激活。
在Raji、C666-1、SNU-719细胞中表达PLpro或nsp3，检测EBNA1蛋白及Zta/Rta转录水平；用shEBNA1验证EBNA1缺失对Zta的诱导。
SARS-CoV-2 VRP感染诱导EBV再激活
验证SARS-CoV-2复制能否在潜伏EBV细胞中诱导再激活。
用SARS-CoV-2复制子颗粒（VRP）感染Raji、C666-1、SNU-719细胞，检测病毒基因组RNA、亚基因组RNA、EBNA1蛋白、Zta/Rta表达及gp350和EBV拷贝数。
VRP感染对EBV肿瘤体内生长的影响
评估SARS-CoV-2感染对EBV驱动肿瘤增殖的体内效应。
Raji细胞皮下接种BALB/c Nude小鼠，成瘤后瘤内注射VRP或PBS，记录体重和肿瘤体积，终点检测肿瘤重量、病毒RNA、EBNA1蛋白、Zta/gp350转录及H&E染色。
AAV9-PLpro对EBV肿瘤体内生长的影响
验证单独PLpro是否足以抑制EBV肿瘤增殖。
同上述Raji异种移植模型，成瘤后瘤内注射AAV9-PLpro或对照，记录体重和肿瘤体积，终点检测PLpro、Zta、gp350转录、EBNA1蛋白及H&E染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965 |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875093 | |
| 胎牛血清 | Gibco | A5670501 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 质粒构建 | MultiF无缝组装混合液 | ABclonal | RM20523 |
| 质粒转染 | Hieff Trans®脂质体转染试剂 | Yeasen Biotechnology | HB220930 |
| VRP感染 | 聚凝胺 | Sigma–Aldrich | H9268 |
| 慢病毒包装 | psPAX2质粒 | Addgene | 12260 |
| RNA提取 | RNA-easy提取试剂 | Vazyme | R701-02-AA |
| 逆转录 | HiScript IV RT SuperMix for qPCR | Vazyme | R423-01 |
| 基因组DNA提取 | PureLink™基因组DNA提取试剂盒 | ThermoFisher Scientific | K182002 |
| qPCR | Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q712-02-AA |
| StepOnePlus实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫荧光 | 抗小鼠二抗 | Invitrogen | A-11005 |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1005 | |
| Zeiss Axio Observer 7显微镜 | Zeiss | -- | |
| EVOS M5000显微镜 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Zeiss LSM900共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测 | 被动裂解液 | Promega | E1941 |
| Dual-Glo®荧光素酶检测系统 | Promega | E1960 | |
| BioTek Synergy H1酶标仪 | BioTek | -- | |
| 免疫共沉淀 | cOmplete™无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 04693132001 |
| 抗Flag纳米抗体磁珠 | AlpaLifeBio | KTSM1338 | |
| CF1542R离心机 | SCILOGEX | -- | |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| 细胞核质分离 | 核质蛋白提取试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0027 |
| Western blot | RIPA裂解液 | CWBIO | CW2333S |
| 硝酸纤维素膜 | Sigma–Aldrich | HATF00010 | |
| 抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗体 | Sino Biological | 40143-R001 | |
| 抗BZLF1（Zta）抗体 | CUSABIO | CSB-PA355980ZA01EFA | |
| 抗EBV EBNA1抗体（1EB12） | Santa Cruz Biotechnology | sc-81581 | |
| 抗GFP抗体 | Abbkine | ABT2021 | |
| 抗6×His抗体 | ThermoFisher Scientific | MA1-21315 | |
| 抗HA小鼠抗体 | ABclonal | AE008 | |
| 抗HA兔抗体 | Proteintech | 81290-1-RR | |
| 抗Flag抗体 | Proteintech | 66008-4-Ig | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Proteintech | 11224-1-AP | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-517576 | |
| 抗Lamin B1抗体 | -- | AB16048 | |
| 抗PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| 抗Caspase 7抗体 | Proteintech | 67956-1-Ig | |
| 抗ACE2抗体 | Proteintech | 66699-1-Ig | |
| IRDye® 800CW山羊抗兔IgG二抗 | Li-COR Biosciences | 926-32211 | |
| IRDye® 680CW山羊抗小鼠IgG二抗 | Li-COR Biosciences | 926-68070 | |
| Li-COR Odyssey红外成像系统 | Li-COR Biosciences | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| H&E染色 | Leica石蜡切片机 | Leica | -- |
| 动物实验 | 基质胶 | Yeasen Biotechnology | 40188ES08 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PLpro切割EBNA1位点验证 | 候选切割位点序列、PLpro催化突变体（C111S、H272A、D286S）、GRL-0617浓度（50或100 μmol/L）和处理时间（48 h） 阅读提示：Methods 2.2、2.12、2.15及Figure 1、Figure 2图注 |
| PLpro核定位与相互作用 | 细胞核质分离缓冲液条件、免疫共沉淀使用anti-Flag Nanobody Magarose Beads、PLpro结构域构建 阅读提示：Methods 2.13、2.14及Figure 3图注 |
| 潜伏EBV再激活细胞实验 | Raji、C666-1、SNU-719细胞培养条件、慢病毒/逆转录病毒感染及嘌呤霉素筛选浓度（1 μg/mL） 阅读提示：Methods 2.1、2.5、2.6及Figure 4图注 |
| SARS-CoV-2 VRP感染 | VRP包装所用质粒量（2 μg VSV-G、10 μg replicon）、DNA/PEI比例1:4、感染时polybrene浓度8 μg/mL及感染后检测时间 阅读提示：Methods 2.4及Figure 5图注 |
| Raji异种移植瘤模型 | 小鼠品系（BALB/c Nude）、周龄（6周）、性别（雌性）、接种细胞数（1×10^7/只）、基质胶比例（1:1）、成瘤后给药时间（5天）及n=5 阅读提示：Methods 2.17及Figure 6、Figure 7图注 |