建立不同强度长期ER应激模型并监测UPR动态
明确不同强度ER应激下UPR三支信号的时间动态。
用Tm（250 ng/mL、1 μg/mL、5 μg/mL）处理HeLa等细胞，通过Annexin V流式、ER未折叠蛋白报告荧光、XBP1剪接PCR、免疫印迹和RT-qPCR监测凋亡及UPR信号。
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钙介导的钙网蛋白-IRE1α相互作用驱动慢性内质网应激下IRE1α活性的动态波动
Calcium-mediated calreticulin-IRE1α interaction drives dynamic fluctuation of IRE1α activity under chronic endoplasmic reticulum stress.
实验完整度
高包含HeLa等多种细胞体外模型、小鼠肝脏体内模型及重组蛋白体外实验，并进行了功能与机制验证
主要模型
HeLa细胞 MDA-MB-231、HEK293T、MEF和C2C12细胞 C57BL/6J小鼠肝脏 重组蛋白体外结合体系
重点核对
Tm处理浓度（250 ng/mL、1 μg/mL、5 μg/mL）及时间点（0–48 h） CALR敲低/敲除与回补（CALR-FLAG、CALR(N)-FLAG，Dox诱导浓度500 ng/mL或1000 ng/mL） CALR(Y92A)和CALR(del52)突变体与IRE1α(LD)的结合能力 EDTA或Tg（5 nM）处理对CALR-IRE1α相互作用及ER腔内Ca2+浓度的影响 小鼠肝脏ZT0、ZT12、ZT22时间点IRE1α磷酸化及CALR/BIP共免疫沉淀
摘要
内质网（ER）应激触发的未折叠蛋白反应（UPR）既可能促进细胞存活，也可能促进细胞凋亡，这取决于应激的持续时间和强度。在（病理）生理条件下，ER应激可持续很长时间，但延长ER应激下UPR的动态调控在很大程度上仍不清楚。在这里，我们表征了药理学诱导的长期ER应激期间的UPR动态，并揭示了多种类型细胞中IRE1α信号的“升-降-升”波动模式。钙网蛋白-IRE1α相互作用强度的波动协调了IRE1α活性的动态调控，该相互作用强度与IRE1α和BIP（一种已知的IRE1α抑制因子）之间的相互作用强度呈负相关。钙网蛋白-IRE1α相互作用受到Ca2+浓度的负向影响，而ER腔内的Ca2+浓度随时间呈现“降-升-降”模式。此外，在小鼠肝脏中观察到钙网蛋白-IRE1α相互作用强度的昼夜节律性波动，并伴随规律生理条件下IRE1α磷酸化水平的振荡。我们的研究表明，一种钙介导、钙网蛋白驱动的IRE1α活性波动，代表了细胞为应对慢性ER应激而采取的一种中间状态，这种状态可能存在于病理生理和生理条件下。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 慢性但非致死性内质网应激下，细胞如何动态调控UPR信号以决定命运？
- 核心机制
- ER腔内Ca2+浓度波动负向调节CALR-IRE1α相互作用，CALR与BIP竞争性结合IRE1α，二者切换驱动IRE1α活性波动。
- 主要证据
- 多种细胞中XBP1剪接和IRE1α磷酸化呈“升-降-升”波动；CALR-IRE1α与BIP-IRE1α相互作用此消彼长；EDTA增强CALR-IRE1α结合；CALR敲低削弱IRE1α再激活并增加凋亡；小鼠肝脏中CALR-IRE1α相互作用呈节律性波动。
- 研究意义
- 提示钙介导、CALR驱动的IRE1α活性波动是细胞应对慢性ER应激的中间状态，可能存在于病理生理和生理条件下。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析中间ER应激下UPR动态
系统映射中间ER应激下与XBP1剪接相关的基因表达模块。
对1 μg/mL Tm处理4、12、24、48 h的HeLa细胞进行RNA-seq，按与XBP1剪接比值的相关性排序基因，取前2000正相关和2000负相关基因进行WGCNA和KEGG分析。
鉴定IRE1α相互作用蛋白及CALR/BIP竞争性结合
揭示IRE1α活性波动的分子机制。
对Tm处理24 h和48 h的HeLa细胞进行IRE1α免疫共沉淀-质谱；用共免疫沉淀、重组蛋白GFP pull-down、截短体、MST和CALR敲除/回补验证CALR与BIP竞争结合IRE1α。
验证Ca2+对CALR-IRE1α相互作用的调控
确定Ca2+是否以及如何调节CALR与IRE1α的结合。
ICP-MS测定CALR结合的Ca2+量；EDTA处理结合蛋白ase K消化、分析超离和MST；Tg（5 nM）快速耗竭ER钙后共免疫沉淀；TuNer-s荧光报告监测ER腔内Ca2+动态。
功能验证CALR-IRE1α互作对IRE1α再激活和细胞凋亡的影响
确定CALR-IRE1α互作在长期ER应激下的功能意义。
CALR敲低/敲除及回补（CALR-FLAG、CALR(N)-FLAG、CALR(Y92A)）后，检测IRE1α磷酸化、XBP1s、caspase-3切割、Annexin V凋亡和JC-1线粒体膜电位；用IRE1α抑制剂KIRA8处理。
小鼠肝脏生理条件下IRE1α节律性激活验证
检验CALR-IRE1α相互作用波动是否存在于体内生理条件。
取8周龄雄性C57BL/6J小鼠肝脏，在ZT0、ZT12、ZT22等时间点检测IRE1α磷酸化及CALR/BIP与IRE1α的共免疫沉淀。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养药物处理 | 衣霉素 | Abcam | ab120296 |
| 毒胡萝卜素 | Sigma | T9033 | |
| KIRA8 | WuXi AppTec | -- | |
| BIX | Aladdin | B288217 | |
| 蛋白消化 | 蛋白酶K | Beyotime | ST533 |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | PAN-Biotech | ST30-3320 |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Invitrogen | ant-pr-1 |
| 潮霉素 | Invitrogen | ant-hg-1 | |
| 诱导表达 | 多西环素 | Cayman | 14422 |
| RT-qPCR | TRNzol总RNA提取试剂 | TIANGEN | DP424 |
| FastQuant逆转录试剂盒（含gDNase） | TIANGEN | KR116 | |
| SuperReal PreMix Plus试剂盒（SYBR Green） | TIANGEN | FP205 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Merck | 539137-10VLCN | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Merck | 524625-1SETCN | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | DINGGUO CHANGSHENG | BCA02 |
| Western blot | ECL Plus检测试剂 | LABLEAD | E1050-1 |
| 免疫共沉淀 | 免疫沉淀裂解液 | Beyotime | P0013 |
| Protein A + G琼脂糖珠 | Beyotime | P2012 | |
| 重组蛋白纯化 | Ni-NTA琼脂糖珠 | QIAGEN | 30210 |
| 大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株 | TransGen Biotech | CD701-02 | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | Amresco | 0487-100 G | |
| GFP pull-down | GFP纳米抗体琼脂糖珠 | Novon | GNA-50-1000 |
| 流式凋亡检测 | FITC Annexin V凋亡检测试剂盒I | BD Biosciences | 556547 |
| 免疫印迹抗体 | ATF-4（D4B8）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 11815 |
| BIP（C50B12）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3177 | |
| 钙网蛋白（F-4）抗体 | Santa Cruz | sc-373863 | |
| Caspase-3（D3R6Y）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 14220 | |
| CHOP（L63F7）鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2895 | |
| Cleaved Caspase-3（Asp175）兔多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| GAPDH（0411）鼠单克隆抗体 | Santa Cruz | sc-47724 | |
| IRE1α（14C10）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3294 | |
| PERK（C33E10）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3192S | |
| 磷酸化IRE1α（S724）兔单克隆抗体 | Abcam | ab124945 | |
| ATF6兔多克隆抗体 | Novus Biologicals | NBP11-75478 | |
| 钙联蛋白兔多克隆抗体 | Abcam | ab22595 | |
| β-actin鼠单克隆抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| GFP鼠单克隆抗体 | sigma | 111814460001 | |
| His鼠单克隆抗体 | proteintech | 66005-1-lg | |
| HA兔多克隆抗体 | proteintech | CL647-51064-2 | |
| 磷酸化SAPK/JNK（Thr183/Tyr185）兔多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9251 | |
| SAPK/JNK兔多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| XBP-1s（D2C1F）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 12782 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 长期ER应激模型建立 | Tm浓度（250 ng/mL、1 μg/mL、5 μg/mL）及处理时间点（0–48 h）；细胞类型和传代状态 阅读提示：Results“UPR fluctuation under prolonged ER stress”及Fig. 1图注；Methods“Cell culture” |
| CALR敲低/敲除与回补 | shCALR或sgRNA序列；Dox诱导浓度（500 ng/mL或1000 ng/mL）；回补构建体（CALR-FLAG、CALR(N)-FLAG、CALR(Y92A)） 阅读提示：Methods“Construction of gene knockout cell lines”“Construction of gene knockdown cell lines”；Fig. 6图注 |
| 重组蛋白结合与竞争实验 | CALR与BIP蛋白浓度比例；ATP或EDTA是否加入；IRE1α(LD)截短体类型 阅读提示：Fig. 4、Fig. 5图注；Methods“GFP pull-down assays”“Protein expression and purification” |
| ER腔内Ca2+动态检测 | TuNer-s转染条件；Tm处理时间点（8、24、48 h）；GFP/CFP比值计算方法 阅读提示：Fig. 5I图注；Methods“Ca2+ imaging in live cells” |
| 小鼠肝脏节律性实验 | 小鼠品系、周龄和性别；光暗周期；取样ZT时间点；每时间点小鼠数量（n=3） 阅读提示：Fig. 7图注；Methods“Animal experiments” |