Restoration of RBM22 overcomes the transcriptional and epigenetic barriers of cardiomyocyte proliferation for heart regeneration.
含新生与成年小鼠心肌特异敲除、AR与MI模型、原代心肌细胞及hiPSC-CM、CUT&Tag/ATAC-seq/ChIP与AAV9过表达功能验证
新生小鼠心肌细胞特异性Rbm22敲除（Rbm22-iCKO）及AR/MI模型 成年小鼠心肌细胞特异性Rbm22敲除及MI模型 新生小鼠原代心肌细胞 人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）
他莫昔芬于P0–P3经胰岛素针给药30 mg/kg体重每日，或成年小鼠腹腔注射30 mg/kg连续3天，给药后14天诱导重组再构建MI 新生小鼠P3行心尖切除（AR，负压抽吸约15%心尖心肌）或永久结扎LAD构建MI；成年8周小鼠永久结扎LAD AAV9-cTnT-Rbm22-GFP以5×10^11 viral genomes/小鼠于结扎后即刻注射至梗死周边心肌 EdU标记：新生鼠组织单次腹腔注射50 mg/kg后8 h取材；成年鼠50 mg/kg每2天一次共7次 检测终点：新生鼠7 dpr/21 dpr；成年鼠14 dpi与28 dpi行EdU/pH3/Aurora B免疫染色、超声与Masson染色
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定RBM22在出生后发育和心脏损伤中的表达动态及其与心肌细胞增殖的相关性。
利用公共转录组数据集（GSE51483、GSE145346、GSE221539、GSE5406等）筛选RBM家族基因；在WT小鼠P1、P4、P7心脏及AR后7 dpr检测RBM22蛋白；分离P1至P56心肌细胞检测mRNA和蛋白；免疫荧光检测α-actinin与RBM22共定位；原代新生心肌细胞缺氧处理检测Rbm22 mRNA。
验证RBM22对新生小鼠心肌细胞增殖和心脏再生能力的必要性。
将Rbm22fl/fl与αMHC-MerCreMer杂交构建他莫昔芬诱导性心肌细胞特异性敲除（Rbm22-iCKO）小鼠，P0–P3给予他莫昔芬后于P3行AR或MI；21 dpr/dpi行超声与Masson染色评估心功能和纤维化，7 dpr行EdU、pH3、Aurora B免疫染色，WGA染色测心肌细胞横截面积，胶原酶消化计数心肌细胞总数。
验证RBM22在成年心肌细胞增殖和梗死后心脏修复中的作用。
8周龄Rbm22-iCKO与对照小鼠接受他莫昔芬后构建MI；28 dpi行超声与Masson染色、分离成年心肌细胞计数、DAPI与cTnT染色分析倍性和单核比例、WGA测细胞大小；14 dpi于梗死边缘区行EdU、pH3、Aurora B免疫染色。另用Rbm22fl/+Myh6-iCre+杂合敲除小鼠验证表型。
明确RBM22缺失对心肌细胞转录组和细胞周期基因表达的影响，并排除RNA稳定性与可变剪接机制。
分离新生Rbm22-iCKO与对照原代心肌细胞检测增殖；以si-Rbm22 #1/#2转染P1原代心肌细胞，免疫荧光检测Ki67、pH3、Aurora B，PI染色流式分析细胞周期；si-Rbm22 #1处理48 h后行RNA-seq及KEGG/GSEA分析，qRT-PCR和免疫印迹验证CDK4、CCNA2、CCNE1、PCNA；放线菌素D处理检测mRNA降解；分析可变剪接事件；转染RRM或ZnF结构域缺失突变体检测细胞周期基因转录。
验证RBM22通过序列特异性结合细胞周期基因启动子而非仅依赖RNA结合功能来激活转录。
亚细胞分级免疫印迹检测RBM22在胞质、核和染色质组分的分布；P1和P8心肌细胞行抗RBM22 CUT&Tag并整合RNA-seq与公共ATAC-seq（GSE178673）、H3K4me3 ChIP-seq（GSE155658）数据；ChIP-qPCR验证RBM22在Cdk4、Ccna2、Ccne1启动子的富集；motif分析、EMSA和双荧光素酶报告（含motif突变）验证直接DNA结合；敲低Cdk4、Ccna2或Ccne1进行功能回复实验。
阐明RBM22调控启动子染色质状态及RNA Pol II招募的分子机制。
si-Rbm22与对照心肌细胞行ATAC-seq及ATAC-qPCR，整合CUT&Tag与RNA-seq定位差异可及区域；免疫共沉淀检测RBM22与SWI/SNF组分（SMARCA4、SMARCC1、SMARCC2）相互作用，HEK293T共表达Flag-RBM22与V5-SMARCA4验证；分子对接预测互作；Re-ChIP检测RBM22与SMARCA4在启动子的共占位；构建Proline-Rich、ZnF、RRM等结构域缺失突变体行Co-IP和报告基因验证；ChIP-qPCR检测SMARCA4、总RNA Pol II及RNA Pol II S2P在启动子的占位。
评估RBM22过表达的体内治疗潜力及对染色质可及性的影响。
构建AAV9-cTnT-Rbm22-GFP，于成年小鼠MI结扎后即刻注射至梗死周边心肌；14 dpi检测EdU/Ki67增殖与Masson纤维化，28 dpi行超声、心肌细胞计数、WGA、倍性与单核比例分析；AAV9-Rbm22处理的成年心肌细胞行ATAC-seq及GO/KEGG分析，ChIP-qPCR检测SMARCA4占位，Co-IP检测RBM22-SMARCA4互作。
评估RBM22在人源心肌细胞中的转化潜力。
将AAV9-Rbm22或AAV9-Ctrl处理hiPSC-CMs 10天，免疫印迹和qRT-PCR验证过表达，免疫荧光检测EdU和Aurora B阳性细胞，qRT-PCR检测心脏功能/成熟标志物及细胞周期基因，CTV稀释结合流式检测分裂。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Rbm22-iCKO小鼠诱导 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 |
| EdU掺入检测 | Click-iT EdU 594成像试剂盒 | Invitrogen | c10339 |
| 心肌细胞增殖检测 | 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 | Invitrogen | c10339 |
| 超声心动图 | Vevo2100超声成像系统 | Visual Sonics | -- |
| 免疫荧光染色 | 抗RBM22抗体 | Novus Biologicals | NBP1-85379 |
| 抗心肌肌钙蛋白T抗体 | Abcam | ab209813 | |
| 抗α-辅肌动蛋白抗体 | Abcam | ab9465 | |
| 抗磷酸化组蛋白H3抗体 | Abcam | ab80612 | |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| 抗Aurora B抗体 | Abcam | ab2254 | |
| 驴抗小鼠Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| 驴抗兔Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11012 | |
| WGA染色 | Alexa Fluor 488偶联小麦胚芽凝集素 | Thermo Fisher Scientific | W11261 |
| 原代心肌细胞分离 | 新生心脏解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| gentle MACS与Octo组织解离仪 | Miltenyi Biotec | -- | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | -- | -- |
| Rbm22敲低 | siGENOME SMART pool siRNA | Dharmacon | M-055902-01-0005 |
| Rbm22 siRNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-15273 | |
| 成年心肌细胞分离 | II型胶原酶 | Worthington | -- |
| 亚细胞分级 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Millipore | 539134 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | Cytiva | 10600002 |
| 抗RBM22抗体 | Bethyl | A303-923A | |
| 抗CDK4抗体 | Proteintech | 11026-1-AP | |
| 抗CCNA2抗体 | Proteintech | 18202-1-AP | |
| 抗CCNE1抗体 | Proteintech | 11554-1-AP | |
| 抗PCNA抗体 | Proteintech | 10205-2-AP | |
| 抗SMARCA4抗体 | Abcam | ab110641 | |
| 抗SMARCC1抗体 | Abcam | ab305037 | |
| 抗SMARCC2抗体 | Abways | AY4215 | |
| 抗Lamin A/C抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-17113 | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9715S | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| 抗Flag标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2044 | |
| 抗V5标签抗体 | Cell Signaling Technology | 13202 | |
| Pierce ECL化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018CN |
| PrimeScript逆转录预混液 | Takara | RR036A | |
| SYBR Green qPCR预混液 | Toyobo | QPK-201 | |
| EMSA | LightShift化学发光EMSA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 20148 |
| 流式细胞周期分析 | 细胞周期检测试剂盒 | Vazyme | AC101 |
| CTV稀释实验 | Cell Trace Violet染料 | Thermo Fisher Scientific | C34557 |
| 流式分析 | BD FACSCelesta细胞分析仪 | BD Biosciences | -- |
| 双荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
| ATAC-seq | Hyperactive ATAC-Seq文库构建试剂盒 | Vazyme | TD711 |
| CUT&Tag | Hyperactive通用CUT&Tag检测试剂盒 | Vazyme | TD903-01 |
| ChIP | 抗RNA聚合酶II抗体 | Active Motif | 39497 |
| 抗RNA聚合酶II S2P抗体 | Abcam | ab5095 | |
| 免疫球蛋白G | Millipore | PP64 | |
| ChIP级Protein G磁珠 | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Re-ChIP | Re-ChIP-IT试剂盒 | Active Motif | 53016 |
| 体内基因递送 | AAV9-cTnT-Rbm22-GFP腺相关病毒 | Genechem Company | -- |
| 体内基因递送对照 | AAV9-cTnT-GFP对照病毒 | Genechem Company | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 心肌细胞特异性Rbm22敲除诱导 | 他莫昔芬剂量30 mg/kg体重、给药时间窗（新生鼠P0–P3每日；成年鼠每日一次连续3天）及成年鼠给药后14天再构建MI 阅读提示：Methods“Animals”小节及Supplementary Fig. 2g–l、Supplementary Fig. 4c, d |
| 新生小鼠AR模型 | 手术日龄P3、低温麻醉方式、负压抽吸约15%心尖心肌、取材时间点7与21 dpr 阅读提示：Methods“Apical resection (AR)”小节与Fig. 2a图注 |
| 新生与成年小鼠MI模型 | 新生鼠MI于P3进行、成年鼠8周龄行LAD永久结扎、AAV9注射剂量5×10^11 viral genomes/小鼠及注射部位为梗死周边心肌 阅读提示：Methods“Myocardial infarction (MI)”小节与Fig. 3a、Fig. 7a图注 |
| EdU掺入标记 | 体外10 µM EdU处理6–8 h；新生鼠组织单次50 mg/kg腹腔注射后8 h取材；成年鼠50 mg/kg每2天一次共7次 阅读提示：Methods“EdU incorporation assay”小节 |
| CUT&Tag与ATAC-seq样本条件 | CUT&Tag使用P1和P8心肌细胞1×10^5、抗RBM22 1:100；ATAC-seq使用si-Rbm22 #1或si-Ctrl #1处理48 h心肌细胞及AAV9注射后14 dpi成年心肌细胞 阅读提示：Methods“CUT&Tag and data analysis”与“Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq) and data analysis”小节 |
| ChIP/Re-ChIP与EMSA机制验证 | ChIP每样本5×10^6心肌细胞、1%无甲醇甲醛交联10 min、抗体稀释1:500；EMSA使用Flag-RBM22转染心肌细胞核提取物与生物素标记探针及2 µg抗Flag抗体进行超迁移 阅读提示：Methods“ChIP and Re-ChIP assays”与“Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)”小节 |
| hiPSC-CMs培养与AAV9处理 | hiPSC-CMs来源CSM-H230110、1%明胶包被、贴壁48–72 h后换心脏维持培养基、每2天换液、AAV9-Rbm22处理10天 阅读提示：Methods“Culture of hiPSC-CMs”小节与Fig. 8图注 |
