Invitrogen™ TRIzol™ 试剂

赛默飞 TRIzol 试剂是一种即用型试剂，该苯酚和 Guanidine isothiocyanate 的单相溶液设计用于在1小时内从人类、动物、植物、酵母或细菌来源的细胞和组织样本中提取高质量的总RNA（以及DNA和蛋白质），TRIzol试剂在样本匀浆化时，可以破坏细胞，溶解细胞组分，同时高效的抑制RNA酶的活性，从而维持RNA的完整性。

TRIzol™ 试剂的主要特点包括：

• 可从同一样品中分离 RNA、DNA 和蛋白
• 拥有卓越的裂解能力，甚至可处理困难的样品类型（CN）₂
• 针对组织、细胞、血清、病毒和细菌进行优化的配方和方案

从多种样品体积和来源中可靠纯化 RNA
TRIzol™ 试剂可很好地处理少量组织 (50–100 mg) 和细胞 (5 × 10⁶) 以及大量组织 (≥1 g) 和细胞 (>10⁷)，且包含用于从人、动物、植物或细菌来源的样品中进行纯化的方案。TRIzol™ 试剂通过在样品均质化期间高效抑制 RNase 活性维持 RNA 的完整性，同时破坏细胞并溶解细胞组分。TRIzol™ 试剂方法的简单性使其可同时处理大量样品。可在不到 1 小时的时间内完成整个程序。通过 TRIzol™ 试剂分离的总 RNA 不含蛋白和 DNA 污染。

其配方可分离多种分子靶标
TRIzol™ 试剂可使您连续沉淀单份样品中的 RNA、DNA 和蛋白。使用 TRIzol™ 试剂均质化样品后，加入氯仿，使匀浆分离成透明的上层水层（含 RNA）、中间相和红色下层有机层（含 DNA 和蛋白）。使用异丙醇从水层中沉淀出 RNA。使用乙醇从中间相/有机层中沉淀出 DNA。通过异丙醇沉淀从苯酚-乙醇上清液中沉淀出蛋白。将沉淀出的 RNA、DNA 或蛋白洗涤以去除杂质，然后重悬以用于下游应用。

TRIzol 使用必学小妙招

准备阶段：

1. 确保实验环境无核酸酶污染，可以使用 RNaseZap™ RNase 去污溶液（货号 AM9780）去除实验台表面和非一次性物品。

2. 实验过程中，请使用一次性手套和不含核酸酶的一次性枪头和离心管，防止引入核酸酶污染。

3. 准备好相应的实验材料：

a. 提取 RNA：异丙醇，乙醇（75%），0.5% SDS 溶液。

b. 提取 DNA：乙醇（100%），乙醇（75%），0.1 M柠檬酸钠溶于 10% 乙醇，8 mM NaOH，HEPES。

c. 提取蛋白质：异丙醇，乙醇（100%），含 0.3 M 盐酸胍的 95% 乙醇，1% SDS 溶液。

tips

实验环境和实验用品的核酸酶污染是导致 RNA 实验失败的重要因素，做好核酸酶清除工作，使用无核酸酶的实验用品，可以让我们实验事半功倍哦！

 

实验步骤：

裂解样本

1. 根据不同样本材料在 TRIzol 试剂中裂解并匀浆化样本。

a. 组织：每 50～100 mg 组织加入 1 mL TRIzol 试剂，用匀浆仪对样本进行匀浆化。

b. 单层培养细胞：移除培养基，每 1×10⁵～10⁷个细胞加入 0.3～0.4 mL TRIzol 试剂，反复吹打匀浆化样本。

c. 细胞悬液：离心后弃除上清液，收集细胞，每 0.25 mL 样本加 0.75 mL 的 TRIzol 试剂，反复吹打以匀浆化。

tips

1）在 TRIzol 试剂中可以防止 RNA 降解，故加入 TRIzol 试剂前，不要洗涤细胞。

2）样本体积不应超过用于裂解的 TRIzol 试剂体积的 10%。

2. 孵育 5 分钟，随后每 1 mL TRIzol 试剂添加 0.2 mL 氯仿，盖紧盖子，剧烈混匀。孵育 2~3 分钟。4℃ 下 12,000×g 离心 15 分钟。

3. 此时混合物分离成为三层，如下图，我们需要将对应提取部分吸出进行后续操作。

tips

Invitrogen™ Phasemaker 分层管（货号：A33248，A33249）可在 TRIzol 混合物样品的水相和有机相间形成一层牢固可靠的胶封，使科研人员能够轻松移取 RNA 相。

 

RNA 提取

1. RNA 沉淀：取尽上层水相，每 1 mL TRIzol 试剂加 0.5 mL 异丙醇。4℃ 孵育10分钟。4℃ 下 12,000×g 离心 10 分钟。此时底部的白色胶状沉淀即为总 RNA 沉淀。弃上清液。

2. RNA 洗涤：每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 试剂，用 1 mL 75% 乙醇重悬沉淀。瞬时漩涡震荡，在 4℃ 下 7,500×g 离心 5 分钟。弃上清，RNA 沉淀在空气中干燥 5～10 分钟。

3. RNA 溶解：用 20～50 μL 不含 RNase 的水，0.1 mM EDTA 或 0.5% SDS 溶液，反复吹打重悬沉淀。在 55～60℃ 孵育 10～15 分钟，然后继续下游实验或者 -70℃ 长期保存。

tips

1）如果起始样本很小（< 10⁶ 个细胞或 < 10 mg 组织），请将 5～10 μg 不含 RNase 的糖原作为载体加入到水相中，这样有助于促进 RNA 沉淀。

2）如果 RNA 会在随后的酶促反应中使用，则切勿将 RNA 溶解在 0.5% SDS 溶液中。

 

DNA 提取

1. DNA 沉淀：完全弃除上层水相，剩余相中每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 试剂添加 0.3 mL 100% 乙醇，盖紧管盖，反复颠倒混匀。孵育 2～3 分钟。4℃ 下 2,000×g 离心 5 分钟，沉淀 DNA，移除溶有蛋白质的上清液。

2. DNA 洗涤：每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 试剂加 1 mL 含 10% 乙醇的 0.1 M 柠檬酸钠（pH 8.5）重悬沉淀。孵育 30 分钟，偶尔轻轻颠倒混合。4℃ 下 2,000×g 离心 5 分钟，弃上清液。重复洗涤步骤一次。对于 DNA 含量较大的样本（＞ 200 μg）可以重复洗涤步骤两次。每 1 mL 用于裂解的TRIzol试剂加入 1.5～2 mL 75% 乙醇重悬沉淀，孵育 10～20 分钟，偶尔轻轻颠倒混合。4℃ 下 2,000×g 离心 5 分钟，弃上清液，沉淀风干 5～10 分钟。

3. DNA 溶解：用 0.3～0.6 mL 的 8 mM NaOH 上下吹打重悬沉淀，4℃ 下 12,000×g 离心 10 分钟，转移上清至新管子中。加 HEPES 调整 PH 用于下游应用或用 HEPES 和 1 mM EDTA 调节 PH 至 7～8 长期存储于 -20℃。

tips

干燥 DNA 的时候，不要用真空离心干燥，会影响 DNA 质量以及后续 DNA 溶解。

 

蛋白质提取

1. 蛋白质沉淀：完全弃除上层水相，剩余相中每 1 mL  用于裂解的 TRIzol 试剂添加 0.3 mL 100% 乙醇，盖紧管盖，反复颠倒混匀。孵育 2～3 分钟。4℃ 下 2,000×g 离心 5 分钟，沉淀 DNA。上清转移至新管中，每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 试剂加 1.5 mL 异丙醇，孵育 10 分钟。在 4℃ 下 12,000×g 离心 10 分钟，弃上清液，留蛋白质沉淀。

2. 蛋白质洗涤：每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 试剂需要加 2 mL 的含 0.3 M 盐酸胍的 95% 乙醇至沉淀中，孵育 20 分钟。在 4℃ 下 7,500×g 离心 5 分钟。弃上清液，沉淀在干燥空气中静置 5～10 分钟。

3. 蛋白质溶解：加入 200 μL 1% SDS 溶液，反复吹打重悬。4℃ 下 10,000×g 离心 10 分钟，将上清转移到新管中。检测蛋白质浓度并用于下游应用或者长期存储与 -20℃ 中。

tips 

蛋白质溶解步骤中的重悬，在 50℃ 水浴或者金属浴中孵育，有助于沉淀重悬充分。