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        UFL1-AKT正反馈环路通过增强脂质合成促进乳腺癌进展

        The UFL1-AKT positive feedback loop promotes breast cancer progression by enhancing lipid synthesis.

        作者信息Fei Meng, Yating Du, Junjie Liang, Huiyan Li, Jingjing Wang, Kexin Tang, Ruixue Kong, Huanran Sun, Tingting Yin, Junru Qin, Xiaomeng Yang, Changliang Shan, Min Liu, Guiwen Yang, Jichun Zhang, Yijie Wang, Jun Zhou, Yan Chen
        PMID41559041
        期刊Nat Commun
        发布时间2026-01
        DOI10.1038/s41467-026-68492-3
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        含细胞系、异种移植小鼠模型、患者组织芯片及LC-MS/MS、Co-IP、UFMylation与激酶实验等多层功能与机制验证

        主要模型

        MDA-MB-231和MDA-MB-468三阴性乳腺癌细胞系 MCF-7、BT474、SK-BR-3乳腺癌细胞系 NOD-SCID小鼠乳腺脂肪垫异种移植瘤模型 人乳腺癌组织芯片（120例肿瘤与46例癌旁组织）

        重点核对

        UFL1 UFMylation位点为AKT1的K189、K276、K297，3K/R突变体用于验证 AKT1磷酸化位点为T308和S473，检测p-AKT1(T308)与p-AKT1(S473) AKT1对UFL1的磷酸化位点为T426，使用p-UFL1(T426)抗体检测 体内药物处理：Fatostatin 30 mg/kg腹腔注射、MK-2206 100 mg/kg口服、DKM 2-93 40 mg/kg腹腔注射，每三天一次 异种移植实验每组小鼠数量及人乳腺癌组织芯片样本量

        摘要

        UFMylation是一种泛素样修饰，对细胞过程至关重要，并与包括癌症在内的人类疾病相关。然而，其在癌症中的作用仍不清楚。在此，我们报道UFL1通过重塑脂质代谢促进乳腺肿瘤生长。机制上，UFL1与AKT相互作用并使其发生UFMylation，增强其在内质网的定位以及PDK1和mTORC2对其的磷酸化，从而增加AKT介导的脂质合成。此外，AKT磷酸化UFL1，增强其活性。因此，UFL1和AKT形成正反馈环路，加速脂质合成和乳腺肿瘤生长。临床上，UFL1水平在人乳腺肿瘤中升高，并与乳腺癌患者的不良临床结局相关。重要的是，UFMylation抑制剂使乳腺癌细胞对AKT抑制剂和抗癌药物敏感。我们的发现揭示了UFMylation在脂质代谢中的关键作用，并确定UFL1-AKT轴是乳腺癌的潜在治疗靶点。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        UFMylation及其唯一E3连接酶UFL1在乳腺癌中的作用及分子机制尚不清楚，本研究拟明确UFL1是否及如何调控乳腺癌脂质代谢与肿瘤生长。
        核心机制
        UFL1在K189、K276、K297位点UFMylate AKT1，破坏PH域与KD域分子内相互作用，促进AKT1在内质网定位及PDK1/mTORC2对其T308和S473的磷酸化；活化的AKT1磷酸化UFL1 T426增强其活性，形成UFL1-AKT1正反馈环路，并通过磷酸化ACLY及促进SREBP1介导的脂质合成基因转录增强脂质合成。
        主要证据
        在多种乳腺癌细胞系中通过Co-IP、GST pull-down、体内外UFMylation与激酶实验、位点突变体（AKT1-3K/R、UFL1-T426A）、亚细胞分离、ORO/BODIPY染色及NOD-SCID小鼠异种移植实验验证；UFL1在乳腺癌组织中升高并与不良预后相关，p-UFL1(T426)与p-AKT1(S473)在TNBC组织中正相关。
        研究意义
        揭示UFMylation在脂质代谢中的关键作用，确定UFL1-AKT1轴为乳腺癌潜在治疗靶点；UFMylation抑制剂可增强乳腺癌细胞对AKT抑制剂及化疗药物（顺铂、依托泊苷）的敏感性。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        UFL1在乳腺癌中的临床表达与致癌功能验证

        评估UFL1在乳腺癌中的表达、临床相关性及其对肿瘤生长的作用

        分析GEPIA、GEO及Kaplan–Meier Plotter数据集，IHC检测人乳腺癌组织芯片；在多种乳腺癌细胞系中用shRNA敲低UFL1进行细胞计数、Ki-67/CC3免疫染色和流式凋亡检测；将MDA-MB-468细胞注入NOD-SCID小鼠乳腺脂肪垫观察肿瘤生长

        2

        UFL1对乳腺癌细胞及肿瘤脂质积累的调控

        验证UFL1是否调控乳腺癌细胞脂质合成与积累

        在UFL1敲低或过表达的TNBC细胞中进行ORO染色、BODIPY 493/503染色及游离脂肪酸和胆固醇定量；用油酸回补、SREBP1抑制剂Fatostatin处理；在异种移植瘤中检测脂质含量及增殖/死亡标志

        3

        UFL1与AKT1相互作用及UFMylation位点鉴定

        确定UFL1是否直接结合并UFMylate AKT1及其修饰位点

        用Flag-UFL1稳转MDA-MB-231细胞进行LC-MS/MS鉴定互作蛋白；Co-IP、GST pull-down、免疫荧光共定位及结构域定位；体内外UFMylation实验及AKT1 K到R单突变和3K/R突变体检测

        4

        AKT1 UFMylation对AKT1活化及脂质合成的功能验证

        验证AKT1 UFMylation是否为其磷酸化、内质网定位及脂质合成所必需

        比较shSC与shUFL1细胞中p-AKT1(T308/S473)水平；比较AKT1-WT与3K/R突变体的磷酸化、PH-KD相互作用、与PDK1/Rictor结合；亚细胞分离检测胞质与内质网AKT1及PIP3结合；检测脂质合成相关蛋白与基因表达

        5

        AKT1 UFMylation缺陷对体内肿瘤生长的影响

        在体内验证AKT1 UFMylation对其致癌功能的必要性

        在shAKT1 MDA-MB-231细胞中回补AKT1-WT或3K/R突变体，注入NOD-SCID小鼠乳腺脂肪垫，检测肿瘤生长、脂质含量及p-AKT1、Ki-67、CC3

        6

        AKT1对UFL1的磷酸化及正反馈环路验证

        验证AKT1磷酸化UFL1 T426并增强UFL1活性，形成正反馈环路

        用p-AKT-sub抗体和体外激酶实验检测UFL1磷酸化；构建UFL1-T426A突变体，检测其对AKT1 UFMylation、磷酸化、脂质积累及体内肿瘤生长的影响；分析TNBC组织中p-UFL1(T426)与p-AKT1(S473)相关性

        7

        UFMylation抑制剂与AKT抑制剂联合效果评估

        评估靶向UFMylation与AKT的联合抗肿瘤效果

        在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中用DKM 2-93与MK-2206单用或联用，检测AKT1 UFMylation、磷酸化、脂质积累和细胞活力，并检测对顺铂和依托泊苷的敏感性；在荷瘤小鼠中评估联合用药的肿瘤生长与脂质含量

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        免疫组织化学Kaplan-Meier生存分析基因集富集分析
        验证细胞功能变化
        细胞计数实验CCK-8细胞活力检测流式细胞术油红O染色BODIPY 493/503染色
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹免疫沉淀逆转录定量PCR免疫荧光
        验证机制链路
        液相色谱-串联质谱GST pull-down实验体内UFMylation实验体外UFMylation实验体外激酶实验亚细胞分离
        评估体内效果
        异种移植小鼠实验
        数据分析与统计
        Pearson相关分析单因素方差分析双因素方差分析Log-rank检验

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养DMEM培养基MacgeneCM15019
        RPMI 1640培养基MacgeneCM10041
        McCoy’s 5 A培养基MacgeneCM10051
        胎牛血清ExCellFSP500
        质粒转染PolyJet转染试剂SignaGenSL100688
        稳定细胞系筛选嘌呤霉素Abcamab141453
        G418MedChemExpressHY-17561
        细胞活力检测CCK-8试剂盒MedChemExpressHY-K0301
        药物处理DKM 2-93MedChemExpressHY-101836
        MK-2206MedChemExpressHY-10358
        依托泊苷SigmaE1383
        顺铂Sigma232120
        FatostatinMedChemExpressHY-14452A
        C75MedChemExpressHY-12364
        JR-AB2-011MedChemExpressHY-14452A
        MK-2206MedChemExpressHY-12464
        DKM 2-93MedChemExpressHY-122022
        免疫荧光染色BODIPY 493/503脂质染料Thermo FisherD3922
        DAPISigma-Aldrich10236276001
        油红O染色油红O染色液Sangon BiotechE607319
        流式凋亡检测Annexin-V-YSFluor 647/PI凋亡检测试剂盒YEASEN40304ES
        免疫沉淀蛋白A/G磁珠Bio-Rad--
        PIP3包被磁珠Echelon BiosciencesP-B345A
        LC-MS/MS抗Flag磁珠BioLinkedInL1103
        蛋白纯化谷胱甘肽-Sepharose 4BGE Healthcare17-0756-01
        RT-qPCRTrizol试剂Invitrogen15596018
        DNase IAmbionAM2224
        iScript逆转录预混液BioRad1708841
        Hieff qPCR SYBR Green预混液YEASEN11201ES08
        游离脂肪酸和胆固醇定量游离脂肪酸含量检测试剂盒SolarbioBC0595
        总胆固醇含量检测试剂盒SolarbioBC1985
        动物实验基质胶ABWBio82704
        细胞培养板6孔板Jet Bio-FiltrationTCP011006
        96孔板Jet Bio-FiltrationTCP011096
        抗体抗Flag抗体Proteintech20543-1-AP
        抗HA抗体Proteintech51064-2-AP
        抗Myc抗体Proteintech16286-1-AP
        抗β-actin抗体Proteintech66009-1-Ig
        抗GAPDH抗体Proteintech10494-1-AP
        抗Rictor抗体Proteintech27248-1-AP
        抗ACC1抗体Proteintech21923-1-AP
        抗ACLY抗体Proteintech15421-1-AP
        抗ACSL3抗体Proteintech20710-1-AP
        抗FASN抗体Proteintech10624-2-AP
        抗UBA5抗体Proteintech12093-1-AP
        抗UFSP2抗体Proteintech16999-1-AP
        抗Ki-67抗体Proteintech27309-1-AP
        抗AKT1抗体Santa Cruz Biotechnologysc-5298
        抗SREBP1抗体Santa Cruz Biotechnologysc-17755
        抗AKT1抗体Cell Signaling Technology2938
        抗磷酸化Akt (Ser473) (D9E)抗体Cell Signaling Technology4060
        抗磷酸化Akt (Thr308) (D25E6)抗体Cell Signaling Technology13038
        抗磷酸化ATP-柠檬酸裂解酶 (Ser455)抗体Cell Signaling Technology4331
        抗磷酸化(Ser/Thr) Akt底物抗体Cell Signaling Technology9611
        抗cleaved caspase 3 (Asp175)抗体Cell Signaling Technology9661
        抗UFL1抗体Sigma-AldrichHPA030559
        抗Flag-M2抗体Sigma-AldrichF1804
        抗UFM1抗体Abcamab109305
        抗钙网蛋白抗体Abcamab92516
        Alexa Fluor 488标记驴抗兔二抗Thermo Fisher ScientificA21206
        Alexa Fluor 594标记驴抗小鼠二抗Thermo Fisher ScientificA21203

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        UFMylation位点与突变体验证
        AKT1突变位点K189、K276、K297及3K/R组合；UFL1 T426A突变体；突变体表达水平需与WT可比
        阅读提示：Methods“Plasmids”及Fig. 3L, M、Fig. 4B、Fig. 6D–G图注
        体内外UFMylation实验
        体外反应体系：0.05% BSA、50 mM HEPES pH7.5、5 mM ATP、10 mM MgCl2，30 °C 2 h；体内实验使用含5% SDS缓冲液煮沸10 min后稀释
        阅读提示：Methods“In vitro UFMylation assay”和“In vivo UFMylation assay”
        AKT1磷酸化与UFL1磷酸化检测
        胰岛素100 nM处理30 min；p-AKT1(T308)、p-AKT1(S473)及p-UFL1(T426)抗体稀释比例
        阅读提示：Methods“In vivo phosphorylation assay”及Fig. 4A、D、Fig. 6B图注
        异种移植与药物处理
        每只小鼠注射2×10^6个MDA-MB-231或MDA-MB-468细胞与等体积Matrigel混合；Fatostatin 30 mg/kg腹腔注射、MK-2206 100 mg/kg口服、DKM 2-93 40 mg/kg腹腔注射，每三天一次；每组5只小鼠
        阅读提示：Methods“Animal studies”及Fig. 2M、Fig. 7I图注
        细胞活力与联合用药
        DKM 2-93 2 μM、MK-2206 0.5 μM、etoposide 0.2 μM、cisplatin 1–2 μM处理4天；脂质染色前1 mM sodium citrate处理12 h
        阅读提示：Methods“Cell viability assays”和“Immunofluorescence staining”及Fig. 7图注

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