人子宫瘢痕组织转录组与病理特征分析
鉴定子宫瘢痕中差异表达基因及病理特征，筛选候选致病因子。
对正常和子宫瘢痕孕妇子宫肌层组织进行RNA-seq、GO富集分析，并用WB、qPCR、免疫组化、Masson和H&E染色验证sFRP2及瘢痕相关标志物。
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鉴定成纤维细胞来源的sFRP2作为治疗靶点并工程化siRNA疗法治疗子宫瘢痕
Identifying fibroblast-derived sFRP2 as a therapeutic target and engineering siRNA therapy for uterine scarring.
实验完整度
高含人子宫肌层样本、原代hUFIBs、小鼠手术瘢痕模型、sFRP2过表达/敲低功能验证及WNT5A/Ca2+机制验证和LNP/siRNA体内治疗。
主要模型
人子宫肌层组织（正常与子宫瘢痕患者） 原代人子宫成纤维细胞（hUFIBs） C57BL/6J雌性小鼠子宫手术瘢痕模型 小鼠子宫成纤维细胞（mUFIBs）
重点核对
sFRP2过表达与敲低对小鼠子宫瘢痕及mUFIBs瘢痕转化的双向功能验证 sFRP2与WNT5A直接结合形成异二聚体并促进WNT5A再分泌的免疫共沉淀与ELISA验证 sFRP2通过FZD5调控子宫成纤维细胞Ca2+内流的Fluo-4 AM流式与免疫荧光验证 LNP/sisFRP2在0.125、0.25、0.5 mg/kg剂量下对小鼠子宫瘢痕的剂量依赖性抑制
摘要
子宫瘢痕是子宫损伤后常见的并发症，其特征是子宫内膜或子宫肌层组织异常伤口愈合。然而，导致瘢痕形成的潜在机制仍不清楚，阻碍了子宫瘢痕有效药物的开发。在此，我们鉴定出分泌型卷曲相关蛋白2（sFRP2）在患有子宫瘢痕的人和小鼠子宫组织中高表达，尤其是在子宫成纤维细胞中。使用雌性小鼠模型，我们证明健康子宫中sFRP2过表达会诱导子宫瘢痕特征并加剧手术诱导的纤维化，而sFRP2敲低则抑制子宫瘢痕发展和子宫成纤维细胞的纤维化转化，突显了sFRP2作为子宫瘢痕发病机制中起始驱动因子的关键作用。机制上，sFRP2通过激活子宫成纤维细胞中的非经典Wnt信号通路和钙内流促进子宫瘢痕形成。此外，通过开发靶向sFRP2的siRNA并工程化脂质纳米颗粒递送系统，证明了靶向sFRP2的治疗潜力。该siRNA疗法有效抑制sFRP2表达，减少子宫瘢痕形成，并改善雌性小鼠的妊娠结局，强调了sFRP2作为子宫瘢痕预防性治疗有前景靶点的治疗潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- sFRP2是否在子宫瘢痕形成中起致病驱动作用，以及靶向sFRP2的siRNA疗法能否预防子宫瘢痕并改善妊娠结局。
- 核心机制
- sFRP2通过激活子宫成纤维细胞中的非经典Wnt信号通路（与WNT5A形成异二聚体促进其再分泌）并经由FZD5增加Ca2+内流，驱动成纤维细胞-肌成纤维细胞转化、ECM沉积和纤维化激活，从而促进子宫瘢痕形成。
- 主要证据
- 人子宫肌层组织和hUFIBs中sFRP2高表达；小鼠子宫手术瘢痕模型中sFRP2升高；sFRP2过表达诱导正常子宫瘢痕特征并加重手术诱导瘢痕，敲低则抑制瘢痕；LNP/sisFRP2降低sFRP2表达、减少瘢痕并改善小鼠妊娠结局。
- 研究意义
- sFRP2可作为子宫瘢痕预防性治疗的靶点，通过LNP介导的siRNA局部递送实现精准预防，并为其他过度瘢痕或纤维化疾病提供靶向治疗思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
人子宫肌层细胞分离与成纤维细胞瘢痕转化验证
确定sFRP2在子宫瘢痕中主要升高的细胞类型及其与成纤维细胞活化的关系。
从正常和瘢痕子宫肌层分离hUSMCs、hUFIBs和hUECs，比较sFRP2表达；对hUFIBs检测瘢痕标志物、迁移和胶原收缩能力。
小鼠子宫手术瘢痕模型建立与验证
在体内重现人子宫瘢痕病理特征并验证sFRP2表达变化。
在雌性C57BL/6J小鼠左侧子宫角中段做1 cm纵向切口穿透肌层和内膜，对照仅做腹部切口；术后30天收集子宫组织进行RNA-seq、WB、qPCR、免疫组化和染色。
sFRP2过表达对正常子宫及手术瘢痕的影响
验证sFRP2是否足以诱导子宫瘢痕特征并加重手术诱导的瘢痕。
将表达sFRP2的慢病毒载体注射入小鼠子宫角，对照注射阴性对照慢病毒；7天后评估过表达效果，部分小鼠随后进行子宫瘢痕手术，30天后分析。
sFRP2敲低对小鼠子宫瘢痕的抑制验证
验证sFRP2敲低是否抑制子宫瘢痕形成。
将携带sFRP2 shRNA的慢病毒注射入小鼠子宫，7天后进行子宫瘢痕手术，30天后评估瘢痕形成及mUFIBs表型。
sFRP2在hUFIBs中的过表达与敲低功能验证
在人子宫成纤维细胞中验证sFRP2对瘢痕转化的直接调控作用。
用慢病毒在正常hUFIBs中过表达sFRP2或敲低sFRP2，敲低组随后用TGF-β刺激，检测瘢痕标志物、迁移和收缩能力。
sFRP2自分泌与旁分泌作用验证
判断sFRP2通过自分泌还是旁分泌途径促进成纤维细胞瘢痕化。
收集WT、sFRP2OE和sFRP2KD hUFIBs的条件培养基，ELISA检测sFRP2浓度，并用条件培养基处理naive hUFIBs，部分补充重组人sFRP2蛋白。
非经典Wnt/WNT5A及Ca2+机制验证
解析sFRP2下游信号通路及与WNT5A、FZD5和Ca2+内流的关系。
GSEA和qPCR检测经典与非经典Wnt标志物；ELISA检测WNT5A分泌；肝素酶处理、免疫共沉淀验证sFRP2-WNT5A结合；Fluo-4 AM流式和免疫荧光检测Ca2+内流；CaCl2刺激验证Ca2+作用。
LNP/sisFRP2体外递送与功能验证
评估LNP包封的sFRP2 siRNA在hUFIBs中抑制瘢痕化的效果。
筛选高效siRNA并包装入离子化脂质纳米颗粒；在TGF-β刺激的hUFIBs中检测sFRP2、WNT5A、VEGFA、α-SMA及纤维化标志物、迁移、收缩和Ca2+内流。
LNP/sisFRP2小鼠体内治疗及妊娠结局评估
验证局部递送LNP/sisFRP2对小鼠子宫瘢痕的预防作用及对妊娠结局的改善。
在子宫瘢痕部位局部给予0.125、0.25、0.5 mg/kg LNP/sisFRP2，30天后评估瘢痕；另以0.5 mg/kg治疗后将雌鼠与雄鼠交配，在E4、E7.5、E12.5、E17.5评估内膜容受性、胚胎定位、吸收率、胎儿和胎盘发育及妊娠结局。
LNP/sisFRP2局部应用安全性评估
评估子宫局部应用LNP/sisFRP2的急性和慢性免疫安全性。
在正常雌性小鼠子宫表面局部应用LNP/sisFRP2或生理盐水，24 h和30天后检测血浆TNF-α、IL-6，子宫和脾组织免疫细胞浸润及器官指数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| LNP制备 | DLin-MC3-DMA | Macklin | -- |
| 二硬脂酰磷脂酰胆碱 | Macklin | -- | |
| 胆固醇 | Macklin | -- | |
| DMG-PEG | Suzhou Highfine Biotech Co., Ltd. | -- | |
| 细胞培养与组织消化 | I型胶原酶 | Solarbio | -- |
| II型胶原酶 | Solarbio | -- | |
| IV型胶原酶 | Solarbio | -- | |
| 胶原收缩实验 | 大鼠尾I型胶原 | Solarbio | -- |
| Western blot | sFRP2抗体 | Proteintech | 66328-1-lg |
| VEGFA抗体 | Proteintech | 19003-1-AP | |
| α-SMA抗体 | Proteintech | 14395-1-AP | |
| 纤维蛋白原抗体 | Proteintech | 20645-1-AP | |
| Col1A1抗体 | Proteintech | 14695-1-AP | |
| Col3A1抗体 | Proteintech | 22734-1-AP | |
| 波形蛋白抗体 | Proteintech | 10366-1-AP | |
| WNT5A抗体 | Affinity | DF6856 | |
| 免疫荧光 | Ki67抗体 | Proteintech | 27309-1-AP |
| 细胞角蛋白7抗体 | Proteintech | 15539-1-AP | |
| 免疫共沉淀 | Flag标签抗体 | Proteintech | 66008-4-lg |
| HA标签抗体 | ABclonal | AE105 | |
| 免疫荧光 | FZD5抗体 | ABclonal | A12775 |
| 免疫组化 | 髓过氧化物酶多克隆抗体 | Proteintech | 22225-1-AP |
| F4/80抗体 | Servicebio | GB113373 | |
| CD3抗体 | Servicebio | GB150004 | |
| Western blot | GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-lg |
| β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-lg | |
| 免疫荧光 | FITC标记山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00003-2 |
| Cy3标记山羊抗小鼠IgG | Proteintech | SA00009-1 | |
| 细胞处理 | 重组人TGF-β蛋白 | Proteintech | HZ1011 |
| 重组人sFRP2蛋白 | MedChemExpress | HY-P77835 | |
| 重组人WNT5A蛋白 | R&D | 645-WN | |
| Ca2+检测 | Fluo-4 AM钙离子荧光探针 | Beyotime | -- |
| 免疫共沉淀 | 抗HA磁珠 | MedChemExpress | HY-K0237 |
| 抗FLAG磁珠 | MedChemExpress | HY-K0207 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Wuhan Servicebio Technology Co. | -- |
| BCA蛋白测定试剂盒 | Wuhan Servicebio Technology Co. | -- | |
| qPCR | SYBR Green预混液 | Bimake | -- |
| 免疫组化 | PV9000免疫组化试剂盒 | ZSGB-Bios | PV9000 |
| DAB显色液 | ZSGB-Bios | ZLI-9019 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人子宫肌层样本采集 | US组为20-35岁单胎妊娠、至少一次剖宫产且诊断为子宫瘢痕者；正常组为20-35岁足月妊娠初产妇；排除妊娠并发症；样本取自子宫瘢痕或切口部位0.5×2.0 cm² 阅读提示：Methods 'Sample collection of human myometrial tissues'及Supplementary Table 1 |
| 小鼠子宫手术瘢痕模型 | 雌性C57BL/6J小鼠5-6周龄15-20 g；左侧子宫角中段1 cm纵向切口穿透肌层和内膜；8-0可吸收缝线闭合；对照仅做腹部切口；术后30天取样 阅读提示：Methods 'Establishment of a mouse model of uterine surgical scarring'及Fig. 3a |
| sFRP2过表达/敲低慢病毒干预 | 慢病毒106 units/只联合polybrene 100 ng子宫角注射；过表达或敲低后7天进行后续实验；对照为阴性对照慢病毒或scramble shRNA 阅读提示：Methods 'Knockdown or overexpression of sFRP2 in the uterine horn of mice in vivo'及Supplementary Fig. 6、13 |
| hUFIBs体外过表达/敲低及TGF-β刺激 | 慢病毒MOI=4，polybrene 6 μg/mL；转染24 h后2.5 μg/mL嘌呤霉素筛选72 h；TGF-β 10 ng/mL处理3天 阅读提示：Methods 'In vitro evaluations of hUFIBs with sFRP2 overexpression or knockdown'及Fig. 5 |
| LNP/sisFRP2制备与表征 | DLin-MC3-DMA:DSPC:胆固醇:DMG-PEG摩尔比50:10:38.5:1.5；脂质与siRNA重量比15:1；siRNA溶于10 mM柠檬酸缓冲液pH 3；微流控混合后透析2 h、0.22 μm过滤 阅读提示：Methods 'Preparation of lipid nanoparticles (LNPs) with or without sisFRP2'及Supplementary Fig. 40、45 |
| LNP/sisFRP2小鼠体内治疗 | 剂量0.125、0.25、0.5 mg/kg sisFRP2局部应用于子宫瘢痕部位；对照为生理盐水或空LNP；治疗后30天评估 阅读提示：Methods 'Prophylactic effects of LNP/sisFRP2 in mice with US'及Fig. 8b |
| 妊娠结局评估 | 治疗30天后与6-8周龄20-25 g雄性C57BL/6J交配；阴道栓日记为E0.5；E4检测Ki67评估内膜容受性；E7.5测量子宫-胚胎轴与M-AM轴夹角，>10°为胚胎定位异常；E12.5超声和吸收率；E17.5胎儿和胎盘指标 阅读提示：Methods 'Evaluations of uterus function and pregnancy outcomes after treatment with LNP/sisFRP2 in mice with US'及Fig. 9 |